אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של IgG אנושי רקומביננטי התמזגו GFP בניקוטיאנה benthamiana. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לטיהור והדמיה חזותית של חלבונים רבים המשתמשים כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, הפרוטוקול הוא הסתגלות למעבדת הוראה פנים אל פנים ווירטואלית במכללה, מתן מחקר מבוסס פרוייקט.
ביקוש גבוה לנוגדנים כהתערבויות טיפוליות למחלות זיהומיות, מטבוליות, אוטואימוניות, ניאופלסטיות ומחלות אחרות יוצר צורך הולך וגדל בפיתוח שיטות יעילות לייצור נוגדנים רקומביננטיים. נכון ל-2019, היו יותר מ-70 נוגדנים חד-קלונליים שאושרו על ידי ה-FDA, ויש פוטנציאל צמיחה אקספוננציאלי. למרות הבטחתם, הגבלת הגורמים לשימוש נרחב הם עלויות ייצור ומורכבות. בפוטנציה, צמחים מציעים אסטרטגיות ייצור חלבון בעלות נמוכה, בטוחה ומדרגית בקלות. צמחים כמו Nicotiana benthamiana לא רק יכול לקפל כראוי להרכיב חלבונים יונקים מורכבים, אלא גם יכול להוסיף שינויים קריטיים לאחר תרגום דומה לאלה המוצעים על ידי תרבויות תאים יונקים. בעבודה זו, באמצעות GFP מקורי וגרסה חומצית יציבה של חלבון פלורסנט ירוק (GFP) התמזגו לנוגדנים חד-שבטיים אנושיים, הצלחנו לדמיין את כל תהליך ההבעה והטיהור של נוגדנים ארעיים מצמחי N. benthamiana. בהתאם למטרת הניסוי, היתוך GFP מקורי יכול להבטיח הדמיה קלה יותר במהלך שלב הביטוי בצמחים, בעוד היתוך GFP יציב חומצה מאפשר הדמיה במהלך עיבוד במורד הזרם. הליך מדרגי וישיר זה יכול להתבצע על ידי חוקר יחיד לייצר כמויות מיליגרם של נוגדנים טהורים מאוד או חלבוני היתוך נוגדנים בעניין של ימים באמצעות רק כמה צמחים קטנים. טכניקה כזו יכולה להיות מורחבת להדמיה של כל סוג של תהליך טיהור נוגדנים ופוטנציאל חלבונים רבים אחרים, הן במערכות צמחים והן במערכות ביטוי אחרות. יתר על כן, טכניקות אלה יכולות להפיק תועלת מהוראות וירטואליות ולהיצא לפועל במעבדת הוראה על ידי סטודנטים לתואר ראשון בעלי ניסיון קודם מינימלי עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית, מתן בסיס למחקר מבוסס פרוייקט עם יישומים בעולם האמיתי.
דו”חות התעשייה מצביעים על כך ש-13 מתוך 20 התרופות המרוויחות ביותר בארה”ב היו ביולוגיות (תרופות מבוססות חלבון), מבין תשע מהן היו נוגדנים. נכון ל-2019, היו יותר מ-570 נוגדנים (Ab)טיפוליים בשלבי פיתוח קליניים שונים 1,2,3. המכירות הגלובליות הנוכחיות של Ab עולות על 100 מיליארד דולר, והשוק הטיפולי המונוקלונלי Ab (mAb) צפוי להניב עד 300 מיליארד דולר עד 20251,4. עם ביקוש גבוה כזה ותוססות צפויות בהכנסות, חוקרים כבר עובדים כדי לפתח דרכים לייצר Ab therapeutics בקנה מידה גדול יותר, עם איכות גבוהה יותר ועלויות נמוכות יותר. מערכות ביטוי המבוססות על צמחים כוללות מספר יתרונות על פני קווי תאים מסורתיים של יונקים לייצור במחיר סביר ובהיקף גדול של Ab therapeutics5,6. ייצור של טיפולים חלבונים בצמחים (“pharming מולקולרי”) אינו דורש ביו-כורים יקרים או מתקני תרבות תאים כמו טכניקות מסורתיות של תרבותתאים יונקים 7,8. צמחים לא יכולים לנדבק בפתוגנים אנושיים, מזעור זיהום פוטנציאלי9. ביטוי חלבון ארעי וטרנסגני המבוסס על צמחים יכול להיות מנוצל כחלופות בעלות נמוכה יותר למערכות ייצור יונקים אוחיידקים 10. למרות צמחים טרנסגניים מועדפים לייצור יבול, ייצור חלבון רקומביננטי באמצעות שיטה זו יכול לדרוש שבועות עד חודשים. התקדמות בביטוי ארעי באמצעות וקטורים ויראליים באמצעות מזרק או ואקום אגרו-סינון מאפשרת ייצור בקנה מידה קטן וגדול, בהתאמה, של החלבון הרצויבימים 11,12,13,14. ייצור mAbs נגד אבולה, דנגה, זיקה, וחלבונים רקומביננטיים רבים אחרים, יוצרו וטוהרו במהירות וביעילות באמצעות ביטוי ארעי בצמחים N. benthamiana 15,16,17,18,19. נסיבות אלה הופכות ביטוי ארעי המבוסס על צמחים לאפשרות אטרקטיבית לפיתוח טיפולי Ab מרובים והשיטות שהוצגו בפרוטוקולזה 20.
הדור הראשון mAbs היו של נגזרת מורין, אשר הביא אימונוגנים לא ספציפיים כאשר נעשה שימוש בניסויים בבניאדם 21. לאורך זמן, כימרית, הומנית, ובסופו של דבר, שרירי בטן אנושיים לחלוטין יוצרו כדי להפחית את החיסונים המושרה על ידי Ab therapeutics. למרבה הצער, חלק Abs אלה עדיין לגרום immunogenicity המארח בשל הבדלים גליקוסילציה21. התפתחויות בהנדסת צמחים אפשרו שינוי של גליקנים Ab, וזה חיוני מאז היציבות והפונקציה של Ab יכול להיות מושפע באופן משמעותי על ידי מצב גליקוסילציהשלה 22. ההתקדמות אפשרה ייצור במערכות צמחים של ביטוי ברמה גבוהה של mAbs הומני, המכיל גליקנים אנושיים וכתוצאה מכך את התכונות הביולוגיות הרצויות של תרופות אדם בייצורהמוני 19,21.
בנוסף שרירי בטן רקומביננטי, מולקולות היתוך Ab (היתוך Ab) נחקרו למטרות שונות בעשורים האחרונים. היתוך Ab מורכב לעתים קרובות שבר Ab או Ab התמזגו מולקולה או חלבון נועדו לעורר תגובות מתאי השפעה חיסונית23. מולקולות אלה נוצרו כהתערבויות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול בפתולוגיות שונות כגוןסרטן ומחלות אוטואימוניות 24,25,26,27. תסביך חיסוני רקומביננטי (RICs) הם סוג נוסף של היתוך Ab שהועסקו כמועמדים לחיסון28. RICs לנצל את היכולת של המערכת החיסונית לזהות אזורי Fc של היתוך Ab נמצאו כדי לשפר את immunogenicity בשילוב עםפלטפורמות חיסון אחרות 29,30,31.
חלבון פלורסנט ירוק (GFP) הוא חלבון ביולומיין המופק מדוזה אקוורה ויקטוריה, אשר פולט אור ירוק כאשר מתרגש אור אולטרהסגול 32,33. במהלך השנים, השימוש של GFP כסמן חזותי של ביטוי גנים התרחב מביטוי בEscherichia קולי למערכות ביטוי חלבון רבות, כולל נ. benthamiana צמחים 34,35,36,37,38. סמנים גלויים, כגון GFP, יש השלכות בשפע בהוראה ולמידה של מושגים מדעיים. סטודנטים רבים ברמה ההדרגתי מתארים קשיים בתפיסת מושגים מדעיים כאשר הרעיון הנלמד אינו גלוי לעין בלתי, כגון המושגים של ביולוגיה מולקולרית ותחומיםקשורים 39. סמנים חזותיים, כמו GFP, יכולים לתרום לעיבוד מידע הקשור לתהליכים המדעיים, יכולים לעזור להפחית את הקשיים שהתלמידים מדווחים עליהם בלימוד מושגים מדעיים רבים.
למרות GFP משמש לעתים קרובות כסמן כדי לציין גן וביטוי vivo, קשה לדמיין את זה בתהליכים במורד הזרם אם באמצעות תנאים חומציים. נסיבות אלה נובעות בעיקר מכך ש-GFP אינו שומר על המבנה שלו ועל הפלואורסץ הנובע מכך ב-pH40 נמוך. סביבות חומציות זמניות נדרשות לעתים קרובות בתהליכי טיהור שונים, כגון חלבון G, חלבון A, וחלבון L כרומטוגרפיה, לעתים קרובותמנוצל עבור Ab טיהור 41,42,43,44. מוטנטים GFP שימשו כדי לשמור על פלואורסצינטי בתנאים חומציים45,46.
בכאן אנו מתארים שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של חלבוני היתוך IgG רקומביננטי בצמחים N. benthamiana. יצרנו GFP מסורתי התמזגו N-terminus של שרשרת כבדה IgG הומני, יצירת היתוך GFP-IgG. במקביל, פיתחנו את ההיתוך של רצף ממוטב codon צמח עבור GFP חומצה יציבה (asGFP) כדי N-terminus של שרשרת כבדה IgG הומני, יצירת היתוך asGFP-IgG. היתרונות של ייצור GFP-IgG כוללים את היכולת לדמיין את הנוכחות של חלבון היעד במהלך הביטוי, בעוד asGFP-IgG מאפשר לראות את הנוכחות של חלבון רקומביננטי לא רק שלבי הביטוי והחילוץ אלא גם בשלבי הטיהור של החלבון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לייצור, טיהור, והדמיה חזותית של מגוון של חלבוני היתוך GFP המיוצר N. benthamiana ומטוהר באמצעות טכניקות כרומטוגרפיה הדורשות pH נמוך. התהליך יכול להיות מותאם גם לכמויות שונות של חומר עלה. בעוד Abs וחלבונים היתוך מתויגים GFP או asGFP אינם מיועדים לשימוש עבור טיפולים, שיטות אלה יכול להיות שימושי כמו פקדים במהלך ניסויים, ניתן גם להשתמש ככלי הוראה לביולוגיה מולקולרית ותאי וביוטכנולוגיה, הן פנים אל פנים וכמעט.
פרוטוקול זה יכול לשמש לאימות חזותי של כל Ab רקומביננטי או חלבון רקומביננטי המיוצר בצמחים N. benthamiana, כולל אלה הדורשים חשיפה זמנית לסביבות חומציות למטרותטיהור עמודה 42,43,44. יתר על כן, ההיתוך של asGFP לחלבונים אחרים במערכות ביטוי שונות יכול ל?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למריה פיה דיפאלמה על עריכת הסרטון. אנו מודים גם למשרד לסיוע חינוכי ושירותי סטודנטים באוניברסיטת אריזונה על הסיוע הנדיב שלהם בדמי פרסום. מחקר עבור פרוטוקול זה נתמך על ידי בית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת אריזונה.
5 mL syringe | any | N/A | |
50 mL syringe | any | N/A | |
Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
Blender with cups | any | N/A | |
Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
Ethanol | any | N/A | |
Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
Heating block | any reputable supplier | N/A | |
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
Polypropylene Column | any | N/A | |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
UV lamp | any | N/A | |
Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |