Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.
Çeşitli enfeksiyöz, metabolik, otoimmün, neoplastik ve diğer hastalıklar için terapötik müdahaleler olarak antikorlar için yüksek talep rekombinant antikor üretimi için verimli yöntemler geliştirilmesinde artan bir ihtiyaç oluşturur. 2019 itibariyle 70’ten fazla FDA onaylı monoklonal antikor vardı ve üstel büyüme potansiyeli var. Onların sözüne rağmen, yaygın kullanım için sınırlayıcı faktörler üretim maliyetleri ve karmaşıklığı vardır. Potansiyel olarak, bitkiler düşük maliyetli, güvenli ve kolayca ölçeklenebilir protein üretim stratejileri sunar. Nicotiana benthamiana gibi bitkiler sadece doğru katlayabilir ve karmaşık memeli proteinleri monte ama aynı zamanda memeli hücre kültürleri tarafından sunulan benzer kritik post-çevirisel değişiklikler ekleyebilirsiniz. Bu çalışmada, yerli GFP ve insan monoklonal antikorlar erimiş yeşil floresan protein (GFP) bir asit kararlı varyantı kullanarak, n. benthamiana bitkilerden tüm geçici antikor ekspresyonu ve arıtma süreci görselleştirmek başardık. Deneyin amacına bağlı olarak, yerli GFP füzyonbitkilerde ifade aşamasında daha kolay görselleştirme sağlayabilir, asit kararlı GFP füzyon aşağı işleme sırasında görselleştirme sağlarken. Bu ölçeklenebilir ve basit prosedür sadece birkaç küçük bitkiler kullanarak birkaç gün içinde son derece saf antikor veya antikor füzyon proteinleri miligram miktarlarda üretmek için tek bir araştırmacı tarafından yapılabilir. Böyle bir teknik antikor saflaştırma süreci ve potansiyel olarak diğer birçok proteinlerin her türlü görselleştirme için genişletilebilir, bitki ve diğer ifade sistemlerinde hem de. Ayrıca, bu teknikler sanal talimatlardan yararlanabilir ve moleküler biyoloji teknikleri konusunda en az deneyime sahip lisans öğrencileri tarafından bir öğretim laboratuvarında yürütülebilir ve gerçek dünya uygulamaları ile proje tabanlı keşif için bir temel sağlar.
Endüstri raporları, Amerika Birleşik Devletleri’nde en çok hasılat yapan yirmi ilaçtan 13’ünün biyolojik (protein bazlı ilaçlar) olduğunu ve bunların dokuzunun antikor olduğunu göstermektedir. 2019 yılı itibariyle, çeşitli klinik gelişimevrelerinde570’in üzerinde antikor (Ab) terapötik1,2,3idi. Mevcut küresel Ab satışları 100 milyar USD aşan ve monoklonal Ab (mAb) terapötik pazar 20251,4tarafından 300 milyar USD kadar üretmek bekleniyor. Bu kadar yüksek talep ve beklenen gelir artışları ile, araştırmacılar daha yüksek kalite ve daha düşük maliyetler ile, her zamankinden daha büyük bir ölçekte Ab terapötik üretmek için yollar geliştirmek için çalışıyoruz. Bitki tabanlı ifade sistemleri Ab terapötik uygun fiyatlı ve büyük ölçekli üretim için geleneksel memeli hücre hatları üzerinde çeşitli avantajları var5,6. Bitkilerde protein terapötik üretimi (“moleküler pharming”) pahalı biyoreaktörler veya hücre kültürü tesisleri geleneksel memeli hücre kültürü teknikleri7,8gibi gerektirmez. Bitkiler insan patojenlerine byüklenici olamaz, potansiyel kontaminasyonu en aza indirir9. Hem geçici hem de transgenik bitki bazlı protein ekspresyonu memeli veya bakteri üretim sistemlerine daha düşük maliyetli alternatifler olarak kullanılabilir10. Mahsul üretimi için transgenik bitkiler tercih edilebilse de, bu yöntemi kullanarak rekombinant protein üretimi haftalar ile aylar arasında sürebilir. Şırınga veya vakum agroinfiltrasyon yoluyla viral vektörler kullanarak geçici ifade gelişmeler, sırasıyla, gün11, 12,13,14istenilen proteinin küçük ve büyük ölçekli üretim için izin verir. Ebola, Dang ve Zika’ya karşı mAbs üretimi ve çok sayıda diğer rekombinant proteinler, hızlı ve verimli N. benthamiana bitkiler15geçici ifade kullanılarak üretilmiş ve saflaştırılmış 15,16,17,18,19. Bu koşullar geçici bitki tabanlı ifade birden fazla Ab terapötik ve bu protokol20gösterilen yöntemler geliştirmek için cazip bir seçenek olun.
Birinci nesil mAb’ler murine türevidir, bu da insan deneylerinde kullanıldığında spesifik olmayan immünjenite ile sonuçlanır21. Zamanla, şeymerik, insancıl, ve sonunda, tamamen insan Abs Ab terapötik tarafından indüklenen immünjenite yi tirmek için üretildi. Ne yazık ki, bu Abs bazıları hala glikozilasyon farklılıkları nedeniyle konak immünojenite neden21. Tesis mühendisliğindeki gelişmeler Ab glikanlarının modifikasyonuna olanak sağlamıştır, bu da ab’nin stabilitesi ve fonksiyonu glikozilasyon durumundan önemli ölçüde etkilenebileceğinden gereklidir22. Gelişmeler insanca mAbs üst düzey ifade bitki sistemlerinde üretim izin verdi, insan glikaniçeren ve sonuçta bir kitle üretilen insan ilaç istenilen biyolojik özellikleri19,21.
Rekombinant Abs ek olarak, Ab füzyon molekülleri (Ab füzyon) son yıllarda çeşitli amaçlar için araştırılmıştır. Ab füzyonları genellikle bir molekül veya proteine kaynaşmış bir Ab veya Ab parçasından oluşur ve bağışıklık efektörü hücrelerinden yanıt almak için tasarlanmıştır23. Bu moleküller kanser ve otoimmün hastalıklar24,25,26,27gibi çeşitli patolojiler tedavi etmek için potansiyel terapötik müdahaleler olarak oluşturulmuştur. Rekombinant bağışıklık kompleksleri (RİCs) aşı adayları28olarak istihdam edilmiştir Ab füzyon başka bir sınıftır. RiCs ab füzyon Fc bölgeleri tanımak için bağışıklık sisteminin yeteneğini yararlanmak ve diğer aşı platformları ile kombine edildiğinde immünojenite geliştirmek için bulunmuştur29,30,31.
Yeşil Floresan Protein (GFP) denizanası Aequorea Victoria elde edilen bir biyolüminesans protein, hangi ultraviyole ışık tarafından heyecanlı yeşil ışık yayan32,33. Yıllar içinde, gen ekspresyonu görsel bir belirteç olarak GFP kullanımı Escherichia coli ifade den çok sayıda protein ekspresyonu sistemleri, N. benthamiana bitkiler34dahil olmak üzere genişletilmiş,35,36,37,38. GFP gibi görünür işaretlerin bilimsel kavramların öğretive öğreniminde çok sayıda etkisi vardır. Çok sayıda giriş seviyesi öğrencisi, öğretilen fikrin çıplak gözle görülemediğinde, moleküler biyoloji ve ilgili alanlar gibi bilimsel kavramları kavramanın zorluklarınıanlatırlar 39. GFP gibi görsel belirteçler, böylece bilimsel süreçlerle ilgili bilgilerin işlenmesine katkıda bulunabilir ve öğrencilerin çok sayıda bilimsel kavramı öğrenmede rapor etme deki zorlukları nazına yardımcı olabilir.
GFP genellikle in vivogen ve ekspresyonu belirtmek için bir belirteç olarak kullanılmasına rağmen, asidik koşullar kullanıyorsanız downstream süreçlerinde görselleştirmek zordur. GFP düşük pH40yapısını ve ortaya çıkan floresan korumak değil çünkü bu durum öncelikle. Geçici asidik ortamlar genellikle protein G, protein A ve protein L kromatografisi gibi çeşitli arıtma süreçlerinde gereklidir, genellikle Ab arıtma için kullanılan41,42,43,44. GFP mutantları asidik koşullar altında floresan korumak için kullanılmıştır45,46.
Burada n. benthamiana bitkilerinde rekombinant IgG füzyon proteinlerinin ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırılması için basit bir yöntem açıklıyoruz. İnsanlaştırılmış bir IgG ağır zincirinin N-terminusuna kaynaşmış geleneksel GFP ürettik ve gfp-igg füzyonu yarattık. Aynı anda, insanlaşmış bir IgG ağır zincirinin N-terminus’una asit-kararlı GFP (asGFP) için bitki kodonu optimize edilmiş bir dizinin füzyonu geliştirdik ve bir asGFP-IgG füzyonu oluşturduk. GFP-IgG üretmenin avantajları arasında ifade sırasında hedef proteinin varlığını görselleştirme yeteneği yer alırken, asGFP-IgG sadece ifade ve ekstraksiyon adımlarında değil, aynı zamanda proteinin saflaştırma adımlarında rekombinant proteinin varlığını da görmenizi sağlar. Bu protokol, N. benthamiana’da üretilen ve düşük pH gerektiren kromatografi teknikleri kullanılarak saflaştırılan bir dizi GFP füzyon proteininin üretimi, saflaştırılması ve görselleştirilmesi için uyarlanabilir. Süreç aynı zamanda yaprak malzeme çeşitli miktarlarda uyarlanmış olabilir. GFP veya asGFP ile etiketlenmiş Abs ve füzyon proteinleri tedaviler için kullanılmak üzere tasarlanmasa da, bu yöntemler deneyler sırasında kontrol olarak yararlı olabilir ve aynı zamanda moleküler ve hücresel biyoloji ve biyoteknoloji için hem bizzat hem de sanal olarak bir öğretim aracı olarak kullanılabilir.
Bu protokol, sütun arıtma amaçlı asidik ortamlara geçici maruz kalma gerektirenler de dahil olmak üzere, N. benthamiana tesislerinde üretilen herhangi bir rekombinant Ab veya rekombinant proteinin görsel doğrulaması için kullanılabilir42,43,44. Ayrıca, farklı ifade sistemlerinde diğer proteinler için ASGFP füzyon deneysel görselleştirme ve eğitim için yararlı bir araç olabilir. Buradaki protokol, …
The authors have nothing to disclose.
Biz video düzenleme için Maria Pia DiPalma teşekkür ederiz. Ayrıca Arizona State Üniversitesi Eğitim Sosyal Yardım ve Öğrenci Hizmetleri Ofisi onların cömert yayın ücreti yardım için teşekkür ederiz. Bu protokol için yapılan araştırmalar Arizona Eyalet Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi tarafından desteklenmiştir.
5 mL syringe | any | N/A | |
50 mL syringe | any | N/A | |
Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
Blender with cups | any | N/A | |
Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
Ethanol | any | N/A | |
Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
Heating block | any reputable supplier | N/A | |
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
Polypropylene Column | any | N/A | |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
UV lamp | any | N/A | |
Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |