Descriviamo qui un metodo semplice per l’espressione, l’estrazione e la purificazione dell’IgG umano ricombinante fuso a GFP a Nicotiana benthamiana. Questo protocollo può essere esteso alla purificazione e visualizzazione di numerose proteine che utilizzano la cromatografia delle colonne. Inoltre, il protocollo è adattabile al laboratorio di insegnamento universitario di persona e virtuale, fornendo esplorazione basata su progetti.
L’elevata domanda di anticorpi come interventi terapeutici per varie malattie infettive, metaboliche, autoimmuni, neoplastiche e altre malattie crea una crescente necessità nello sviluppo di metodi efficienti per la produzione di anticorpi ricombinanti. A dicembre 2019, c’erano più di 70 anticorpi monoclonali approvati dalla FDA e c’è un potenziale di crescita esponenziale. Nonostante la loro promessa, i fattori limitanti per un uso diffuso sono i costi di produzione e la complessità. Potenzialmente, le piante offrono strategie di produzione proteica a basso costo, sicure e facilmente scalabili. Piante come Nicotiana benthamiana non solo possono piegare e assemblare correttamente proteine mammifere complesse, ma possono anche aggiungere modifiche critiche post-tras traslazione simili a quelle offerte dalle colture cellulari dei mammiferi. In questo lavoro, utilizzando la GFP nativa e una variante stabile all’acido della proteina fluorescente verde (GFP) fusa agli anticorpi monoclonali umani, siamo stati in grado di visualizzare l’intera espressione anticorpale transitoria e il processo di purificazione dalle piante di N. benthamiana. A seconda dello scopo dell’esperimento, la fusione GFP nativa può garantire una visualizzazione più semplice durante la fase di espressione nelle piante, mentre la fusione GFP stabile all’acido consente la visualizzazione durante l’elaborazione a valle. Questa procedura scalabile e diretta può essere eseguita da un singolo ricercatore per produrre quantità di milligrammo di anticorpi altamente puri o proteine di fusione anticorpale in pochi giorni utilizzando solo poche piccole piante. Tale tecnica può essere estesa alla visualizzazione di qualsiasi tipo di processo di purificazione degli anticorpi e potenzialmente di molte altre proteine, sia nei sistemi vegetali che in altri sistemi di espressione. Inoltre, queste tecniche possono beneficiare di istruzioni virtuali ed essere eseguite in un laboratorio didattico da studenti universitari in possesso di una minima esperienza precedente con tecniche di biologia molecolare, fornendo una base per l’esplorazione basata su progetti con applicazioni del mondo reale.
I rapporti dell’industria indicano che tredici dei venti farmaci più incassi negli Stati Uniti erano biologici (prodotti farmaceutici a base proteica), di cui nove erano anticorpi. A dicembre 2019, c’erano oltre 570 terapie anticorpali (Ab) in varie fasi di sviluppoclinico 1,2,3. Le attuali vendite globali di Ab superano i 100 miliardi di dollari e il mercato terapeutico monoclonale Ab (mAb) dovrebbe generare fino a 300 miliardi di DOLLARI entro il 20251,4. Con una domanda così elevata e aumenti previsti delle entrate, i ricercatori hanno lavorato per sviluppare modi per produrre terapie Ab su scala sempre più ampia, con una qualità più elevata e costi inferiori. I sistemi di espressione a base vegetale hanno diversi vantaggi rispetto alle tradizionali linee cellulari di mammiferi per la produzione economica e su larga scala di terapie Ab5,6. La produzione di terapie proteiche nelle piante (“pharming molecolare”) non richiede costosi bioreattori o strutture di coltura cellulare, così come le tecniche tradizionali di coltura cellulare dei mammiferi7,8. Le piante non possono contrarre agenti patogeni umani, riducendo al minimo la potenzialecontaminazione 9. Sia l’espressione proteica transiente che transgenica a base vegetale può essere utilizzata come alternativa a basso costo ai sistemi di produzione di mammiferi o batteri10. Sebbene le piante transgeniche siano preferite per la produzione vegetale, la produzione di proteine ricombinanti utilizzando questo metodo può richiedere da settimane a mesi. I progressi nell’espressione transitoria utilizzando vettori virali attraverso siringa o agroinfiltrazione sottovuoto consentono, rispettivamente, la produzione su piccola e grande scala della proteina desiderata neigiorni 11,12,13,14. La produzione di mAb contro Ebola, Dengue e, Zika, e numerose altre proteine ricombinanti, sono stati prodotti e purificati in modo rapido ed efficiente utilizzando l’espressione transitoria negli impianti N. benthamiana 15,16,17,18,19. Queste circostanze rendono l’espressione transitoria a base vegetale un’opzione interessante per lo sviluppo di più terapie Ab e dei metodi dimostrati in questo protocollo20.
I mAb di prima generazione erano di derivazione murina, il che ha portato a immunogenicità non specifica se utilizzati in studi sull’uomo21. Nel corso del tempo, gli Abs chimerici, umanizzati e, infine, completamente umani sono stati prodotti per ridurre l’immunogenicità indotta dalle terapie Ab. Sfortunatamente, alcuni di questi Abs causano ancora immunogenicità dell’ospite a causa delle differenze nella glicosilazione21. Gli sviluppi nell’ingegneria impiantistica hanno permesso la modifica degli glicani ab, che è essenziale poiché la stabilità e la funzione di ab possono essere significativamente influenzate dal suo stato di glicosilazione22. I progressi hanno permesso la produzione in sistemi vegetali di espressione di alto livello di mAb umanizzati, contenenti glicani umani e di conseguenza i tratti biologici desiderati di un farmaco umano prodotto inserie 19,21.
Oltre agli Abs ricombinanti, le molecole di fusione Ab (fusioni Ab) sono state esplorate per vari scopi negli ultimi decenni. Le fusioni ab spesso consistono in un frammento ab o ab fuso a una molecola o proteina e sono progettate per suscitare risposte dalle cellule dell’effettore immunitario23. Queste molecole sono state create come potenziali interventi terapeutici per trattare varie patologie come il cancro e le malattie autoimmuni24,25,26,27. I complessi immunitari ricombinanti (RIC) sono un’altra classe di fusioni Ab che sono state impiegate come candidati al vaccino28. I RIC sfruttano la capacità del sistema immunitario di riconoscere le regioni Fc delle fusioni Ab e sono stati trovati per migliorare l’immunogenicità se combinati con altre piattaformevaccinali 29,30,31.
La proteina fluorescente verde (GFP) è una proteina bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea Victoria, che emette luce verde quando eccitata dalla luceultravioletta 32,33. Nel corso degli anni, l’uso della GFP come marcatore visivo dell’espressione genica si è esteso dall’espressione in Escherichia coli a numerosi sistemi di espressione proteica, tra cui le piante di N. benthamiana 34,35,36,37,38. I marcatori visibili, come la FPG, hanno abbondanti implicazioni nell’insegnamento e nell’apprendimento di concetti scientifici. Numerosi studenti entry-level descrivono difficoltà a cogliere concetti scientifici quando l’idea insegnata non è visibile ad occhio nudo, come i concetti di biologia molecolare e campi correlati39. I marcatori visivi, come la GFP, possono così contribuire all’elaborazione delle informazioni relative ai processi scientifici e potrebbero contribuire a ridurre le difficoltà che gli studenti segnalano nell’apprendimento di numerosi concetti scientifici.
Sebbene la GFP sia spesso usata come marcatore per indicareil gene e l’espressione in vivo , è difficile visualizzarlo nei processi a valle se si utilizzano condizioni acide. Questa circostanza è principalmente perché GFP non mantiene la sua struttura e la fluorescenza risultante a un basso pH40. Gli ambienti acidi temporanei sono spesso richiesti in vari processi di purificazione, come la proteina G, la proteina A e la cromatografia proteina L, spesso utilizzate per la purificazione Ab41,42,43,44. I mutanti GFP sono stati utilizzati per trattenere la fluorescenza in condizioniacide 45,46.
Nel presente documento descriviamo un metodo semplice per l’espressione, l’estrazione e la purificazione delle proteine di fusione IgG ricombinanti nelle piante di N. benthamiana. Abbiamo prodotto la GFP tradizionale fusa all’N-terminale di una catena pesante IgG umanizzata, creando una fusione GFP-IgG. Contemporaneamente, abbiamo sviluppato la fusione di una sequenza ottimizzata per il codone vegetale per una GFP acido-stabile (asGFP) al N-terminale di una catena pesante IgG umanizzata, creando una fusione asGFP-IgG. I vantaggi della produzione di GFP-IgG includono la capacità di visualizzare la presenza di una proteina bersaglio durante l’espressione, mentre asGFP-IgG consente di vedere la presenza di proteine ricombinanti non solo nelle fasi di espressione ed estrazione ma anche nelle fasi di purificazione della proteina. Questo protocollo può essere adattato per la produzione, la purificazione e la visualizzazione di una gamma di proteine di fusione GFP prodotte in N. benthamiana e purificate utilizzando tecniche di cromatografia che richiedono un basso pH. Il processo può anche essere adattato a varie quantità di materiale fogliare. Mentre l’Abs e le proteine di fusione contrassegnate con GFP o asGFP non sono destinate ad essere utilizzate per le terapie, questi metodi possono essere utili come controlli durante gli esperimenti e possono anche essere ulteriormente utilizzati come strumento di insegnamento per la biologia molecolare e cellulare e la biotecnologia, sia di persona che virtualmente.
Questo protocollo può essere utilizzato per la verifica visiva di qualsiasi ab ricombinante o proteina ricombinante prodotta nelle piante di N. benthamiana, comprese quelle che richiedono un’esposizione temporanea ad ambienti acidi ai fini della purificazione dellecolonne 42,43,44. Inoltre, la fusione di asGFP con altre proteine in diversi sistemi di espressione può essere uno strumento utile per la visualizzazione sp…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Maria Pia DiPalma per aver modificato il video. Ringraziamo anche l’Office of Educational Outreach and Student Services dell’Arizona State University per la loro generosa assistenza alle tasse di pubblicazione. La ricerca per questo protocollo è stata supportata dalla School of Life Sciences, Arizona State University.
5 mL syringe | any | N/A | |
50 mL syringe | any | N/A | |
Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
Blender with cups | any | N/A | |
Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
Ethanol | any | N/A | |
Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
Heating block | any reputable supplier | N/A | |
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
Polypropylene Column | any | N/A | |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
UV lamp | any | N/A | |
Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |