ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造
Summary
ここでは、 ニコティアナベンタミアナでGFPに融合した組換えヒトIgGの発現、抽出、精製のための簡単な方法について説明します。このプロトコルはカラムクロマトグラフィーを利用する多数のタンパク質の精製および可視化に拡張することができる。さらに、このプロトコルは対人および仮想大学の教育研究所に適応可能であり、プロジェクトベースの探査を提供する。
Abstract
様々な感染性、代謝、自己免疫、新生物、および他の疾患の治療介入として抗体の需要が高く、組換え抗体産生のための効率的な方法を開発する必要性が高まっています。2019年現在、FDA承認モノクローナル抗体は70種類を超えており、指数関数的な成長の可能性があります。彼らの約束にもかかわらず、広範囲にわたる使用のための制限要因は、製造コストと複雑さです。潜在的に、植物は低コストで安全で、容易に拡張可能なタンパク質製造戦略を提供します。 ニコティアナベンタミアナ のような植物は、複雑な哺乳類タンパク質を正しく折りたたんで組み立てることができるだけでなく、哺乳類の細胞培養物と同様の重要な翻訳後修飾を追加することができます。本研究では、ヒトモノクローナル抗体に融合した天然GFPと酸性安定型の緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いることで 、N.ベンタミアナ 植物からの一過性抗体の発現および精製プロセス全体を可視化することができた。実験の目的に応じて、ネイティブGFP融合は植物の発現段階での可視化を容易にし、酸安定性のGFP融合は下流処理中の視覚化を可能にする。このスケーラブルで簡単な手順は、わずか数個の小さな植物を使用して数日のうちに非常に純粋な抗体または抗体融合タンパク質のミリグラム量を生成するために、単一の研究者によって行うことができます。このような技術は、植物および他の発現系の両方で、あらゆる種類の抗体精製プロセスおよび潜在的に他の多くのタンパク質の可視化に拡張することができる。さらに、これらの技術は、仮想命令に利益をもたらし、分子生物学技術の経験を最小限に抑えた学部生によって教育研究室で実行され、実際のアプリケーションでプロジェクトベースの探査の基盤を提供します。
Introduction
業界の報告によると、米国で最も高く評価されている20種類の医薬品のうち13種類が生物学的製剤(タンパク質ベースの医薬品)であり、そのうち9薬が抗体であった。2019年時点で、様々な臨床開発段階で570以上の抗体(Ab)治療薬が1、2、3であった。現在の世界のAbの売上高は1,000億米ドルを超え、モノクローナルAb(mAb)治療市場は2025年1、4.4年までに最大3,000億米ドルを生み出す見込みです。このような高い需要と収益の増加が見込まれる中、研究者は、より高品質で低コストで、これまで以上に大きな規模でAb治療薬を生産する方法の開発に取り組んできました。植物ベースの発現系は、Ab治療薬5,6の手頃な価格で大規模な製造のための伝統的な哺乳類細胞株に対していくつかの利点がある。植物におけるタンパク質治療の生産(「分子ファーミング」)は、伝統的な哺乳類細胞培養技術7,8のように高価なバイオリアクターまたは細胞培養施設を必要としない。植物は人間の病原体を収縮させることはできず、潜在的な汚染を最小限に抑える9.一過性およびトランスジェニック植物ベースのタンパク質発現はいずれも、哺乳動物または細菌産生系10に対する低コストの代替として利用することができる。トランスジェニック植物は作物の生産に好ましいが、この方法を用いた組換えタンパク質の生産には数週間から数カ月が必要となる。シリンジまたは真空アグロインフィルを介したウイルスベクターを用いた過渡発現の進歩により、それぞれ、11日目、12日、13日、14日目に所望のタンパク質の小規模および大規模な産生が可能になる。エボラ出血熱に対するmAbsの産生は、デング熱および、ジカ、および他の多くの組換えタンパク質が、N.ベンタミアナ植物15、16、17、18、19において一過性発現を用いて迅速かつ効率的に産生および精製された。これらの状況は、一過性植物ベースの発現を複数のAb治療薬を開発するための魅力的な選択肢と、このプロトコル20で示された方法を作る。
第1世代mAbsはマウス誘導であり、ヒト試験21で使用すると非特異的な免疫原性をもたらした。時間が経つにつれて、キメラ、ヒト化、そして最終的には、アブ療法によって誘発される免疫原性を低下させるために完全にヒト腹筋が産生された。残念ながら、これらの腹筋のいくつかは、グリコシル化21の違いのために宿主免疫原性を引き起こす。植物工学の発展は、Abの安定性と機能がそのグリコシル化状態22によって著しく影響を受ける可能性があるため不可欠であるAbグリカンの修飾を可能にした。進歩により、ヒト化mAbsの高レベル発現の植物系での生産が可能となり、ヒトグリカンを含み、結果的に大量生産されたヒト医薬19,21の所望の生物学的形質を含む。
組み換えAbsに加えて、Ab融合分子(Ab融合)は、ここ数十年で様々な目的のために探求されてきた。Ab融合は、しばしば分子またはタンパク質に融合したAbまたはAb断片から構成され、免疫エフェクター細胞23からの応答を引き出すために設計されている。これらの分子は、癌や自己免疫疾患24、25、26、27などの様々な病理を治療するための潜在的な治療介入として作成されています。組換え免疫複合体(IC)は、ワクチン候補28として採用されているAb融合の別のクラスである。ICは、Ab融合のFc領域を認識する免疫系の能力を利用し、他のワクチンプラットフォーム29、30、31と組み合わせると免疫原性を改善することが分かった。
緑色蛍光タンパク質(GFP)はクラゲエーコレアビクトリアに由来する生物発光タンパク質であり、紫外線32、33で励起すると緑色の光を発する。長年にわたり、GFPの遺伝子発現の視覚マーカーとしての使用は、大腸菌の発現から、N.ベンタミアナ植物34、35、36、37、38を含む多数のタンパク質発現系へと拡大してきた。GFPのような目に見えるマーカーは、科学的概念の教えと学習に豊富な意味を持っています。多くのエントリーレベルの学生は、分子生物学の概念や関連分野39など、教えられている考えが肉眼では見えない場合に科学的概念を把握することの難しさを説明する。GFPのような視覚マーカーは、科学的プロセスに関連する情報の処理に貢献することができ、学生が多くの科学的概念を学ぶ上で報告する困難を軽減するのに役立ちます。
GFPは生体内で遺伝子や発現を示すマーカーとしてよく用いられますが、酸性条件を使用する場合は下流工程で可視化することは困難です。この状況は主に、GFPが低pH40でその構造および結果蛍光を維持しないためである。一時的な酸性環境は、タンパク質G、プロテインA、およびプロテインLクロマトグラフィーなどの様々な精製プロセスにおいてしばしば必要とされ、Ab精製41、42、43、44にしばしば利用される。GFP変異体は、酸性条件下で蛍光を保持するために用いられてきた45,46.
ここで 、N.ベンタミアナ 植物における組換えIgG融合タンパク質の発現、抽出、精製のための簡単な方法について述べている。ヒト化IgG重鎖のN末流に融合した伝統的なGFPを製造し、GFP-IgG融合を生み出しました。同時に、酸安定性GFP(asGFP)の植物コドン最適化配列をヒト化IgG重鎖のN末流に融合させ、asGFP-IgG融合を生み出しました。GFP-IgGを製造する利点は、発現中に標的タンパク質の存在を可視化する能力を含むが、asGFP-IgGは、発現および抽出ステップだけでなく、タンパク質の精製ステップにおいても組換えタンパク質の存在を見ることができる。このプロトコルは 、N.ベンタミナ で産生されるGFP融合タンパク質の生産、精製、可視化に適応し、低pHを必要とするクロマトグラフィー技術を使用して精製することができます。プロセスはまた葉材料の様々な量に合わせることができる。GFPまたはasGFPでタグ付けされた腹筋および融合タンパク質は、治療に使用することを意図していませんが、これらの方法は実験中のコントロールとして有用であり、また、分子細胞生物学とバイオテクノロジーの教育ツールとしても、対人的にも仮想的にも利用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、N.ベンタミアナ植物で産生される任意の組換えAbまたは組換えタンパク質の視覚的検証に利用することができ、カラム精製目的で酸性環境への一時的な暴露を必要とするものである42、43、44。さらに、異なる発現系における他のタンパク質へのasGFPの融合は、実験的な可視化および教育のための有…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ビデオを編集するためのマリアピアディパルマに感謝します.また、アリゾナ州立大学の教育アウトリーチと学生サービス局の寛大な出版料援助に感謝します。このプロトコルの研究は、生命科学の学校によってサポートされました, アリゾナ州立大学.
Materials
| 5 mL syringe | any | N/A | |
| 50 mL syringe | any | N/A | |
| Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| Blender with cups | any | N/A | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| Heating block | any reputable supplier | N/A | |
| Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
| Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
| PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
| Polypropylene Column | any | N/A | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
| Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
| Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
| Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
| TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| UV lamp | any | N/A | |
| Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
| Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
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