Vitrificatie van in vitro gerijpte oöcyten verzameld uit volwassen en prepubertale eierstokken bij schapen
Summary
Het protocol is gericht op het bieden van een standaardmethode voor de vitrificatie van volwassen en juveniele schapenoöcyten. Het omvat alle stappen van de bereiding van de in vitro rijpingsmedia tot de post-opwarmingscultuur. Oöcyten worden in het MII-stadium ge verglaasd met behulp van Cryotop om het minimale essentiële volume te garanderen.
Abstract
Bij vee kunnen in vitro embryoproductiesystemen worden ontwikkeld en onderhouden dankzij het grote aantal eierstokken en oöcyten dat gemakkelijk uit een slachthuis kan worden verkregen. Volwassen eierstokken dragen altijd verschillende antrale follikels, terwijl bij pre-puberale donoren de maximale aantallen oöcyten beschikbaar zijn op de leeftijd van 4 weken, wanneer eierstokken piekaantallen antrale follikels dragen. 4 weken oude lammeren worden dus beschouwd als goede donoren, zelfs als de ontwikkelingscompetentie van prepubertale oöcyten lager is in vergelijking met hun volwassen tegenhanger.
Fundamenteel onderzoek en commerciële toepassingen zouden worden versterkt door de mogelijkheid om met succes gepreserveerde oöcyten te cryopreserveren die zijn verkregen van zowel volwassen als prepuberale donoren. De vitrificatie van oöcyt verzameld van prepuberale donoren zou ook het mogelijk maken om het generatie-interval te verkorten en zo de genetische winst in fokprogramma’s te vergroten. Het verlies van ontwikkelingspotentieel na cryopreservatie maakt zoogdieroöcyten echter waarschijnlijk een van de moeilijkste celtypen om te cryopreserveren. Onder de beschikbare cryopreservatietechnieken wordt vitrificatie op grote schaal toegepast op dierlijke en menselijke oöcyten. Ondanks recente vooruitgang in de techniek veroorzaken blootstellingen aan hoge concentraties cryoprotectieve middelen, evenals koelschade en osmotische stress nog steeds verschillende structurele en moleculaire veranderingen en verminderen ze het ontwikkelingspotentieel van zoogdieroocyten. Hier beschrijven we een protocol voor de vitrificatie van schapenoöcyten verzameld bij jonge en volwassen donoren en gerijpt in vitro voorafgaand aan cryopreservatie. Het protocol omvat alle procedures, van oöcyt in vitro rijping tot vitrificatie, opwarming en incubatieperiode na opwarming. Oöcyten die in het MII-stadium worden geprefereerd, kunnen inderdaad worden bevrucht na opwarming, maar ze hebben extra tijd nodig voorafgaand aan de bevruchting om schade als gevolg van cryopreservatieprocedures te herstellen en hun ontwikkelingspotentieel te vergroten. Zo zijn de omstandigheden en timing van de cultuur na de opwarming cruciale stappen voor het herstel van het ontwikkelingsmogelijkheden van oöcyt, vooral wanneer oöcyt wordt verzameld bij jonge donoren.
Introduction
Langdurige opslag van de vrouwelijke gameten kan een breed scala aan toepassingen bieden, zoals het verbeteren van de fokkerij van huisdieren door genetische selectieprogramma’s, het bijdragen aan het behoud van de biodiversiteit door middel van het ex-situ programma voor het behoud van diersoorten in de natuur, en het stimuleren van in vitro biotechnologisch onderzoek en toepassingen dankzij de beschikbaarheid van opgeslagen oöcyten die moeten worden opgenomen in in vitro embryoproductie of nucleaire transplantatieprogramma ‘s1,2,3. Juveniele oöcyt vitrificatie zou ook de genetische winst verhogen door het generatie-interval in fokprogramma’s te verkorten4. Vitrificatie door ultrasnelle koeling en opwarming van oöcyten wordt momenteel beschouwd als een standaardbenadering voor cryopreservatie van dierlijke oöcyten5. Bij herkauwers worden oöcyten vóór vitrificatie meestal in vitro gerijpt, na het ophalen van follikels verkregen uit eierstokken van slachthuizen2. Volwassen, en vooral prepubertal eierstokken4,6, kunnen inderdaad een vrijwel onbeperkt aantal te cryopredienen oöcyten leveren.
Bij runderen, na oöcyt vitrificatie en opwarming, blastocyst opbrengsten op >10% zijn vaak gemeld door verschillende laboratoria in het afgelopen decennium3. Bij kleine herkauwers wordt oöcyt vitrificatie echter nog steeds als relatief nieuw beschouwd voor zowel juveniele als volwassen oöcyt, en een standaardmethode voor de vitrificatie van schapenöcyt moet nog worden vastgesteld2,5. Ondanks recente vooruitgang vertoont de verglaasde en opgewarmde oöcyt inderdaad verschillende functionele en structurele veranderingen die hun ontwikkelingspotentieel beperken7,8,9. Zo hebben weinig artikelen gemeld blastocyst ontwikkeling bij 10% of meer in verglaasde / opgewarmde schapenoöcyten2. Er zijn verschillende benaderingen onderzocht om de bovengenoemde wijzigingen te verminderen: optimalisering van de samenstelling van de vitrificatie- en ontdooioplossingen10,11; experimenteren met het gebruik van verschillende cryo-apparaten8,12,13; en het toepassen van specifieke behandelingen tijdens in vitro rijping (IVM)4,14,15 en/of tijdens de hersteltijd na opwarming6.
Hier beschrijven we een protocol voor de vitrificatie van schapenoöcyten verzameld bij jonge en volwassen donoren en gerijpt in vitro voorafgaand aan cryopreservatie. Het protocol omvat alle procedures, van oöcyt in vitro rijping tot vitrificatie, opwarming en post-warming cultuurperiode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oöcyt cryopreservatie bij huisdieren kan niet alleen de instandhouding van vrouwelijke genetische hulpbronnen op lange termijn mogelijk maken, maar ook de ontwikkeling van embryonale biotechnologie bevorderen. De ontwikkeling van een standaardmethode voor oöcyt vitrificatie zou dus zowel de veehouderij als de onderzoekssector ten goed komen. In dit protocol wordt een volledige methode voor volwassen schapenocyt vitrificatie gepresenteerd en zou een solide uitgangspunt kunnen zijn voor de ontwikkeling van een efficiënt…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs kregen geen specifieke financiering voor dit werk. Professor Maria Grazia Cappai en Dr. Valeria Pasciu worden dankbaar erkend voor de video voice-over en voor het opzetten van het lab tijdens het maken van de video.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
Referenzen
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell’Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).
