Vitrificação de Oócitos Maduros In Vitro coletados de ovários adultos e prepubertais em ovelhas
Summary
O protocolo visa fornecer um método padrão para a vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e juvenis. Inclui todos os passos desde a preparação dos meios de amadurecimento in vitro até a cultura pós-aquecimento. Os oócitos são vitrificados na fase MII usando o Cryotop para garantir o volume essencial mínimo.
Abstract
Na pecuária, sistemas de produção de embriões in vitro podem ser desenvolvidos e sustentados graças ao grande número de ovários e oócitos que podem ser facilmente obtidos de um matadouro. Ovários adultos sempre carregam vários folículos antrais, enquanto em doadores pré-pubertal o número máximo de oócitos está disponível às 4 semanas de idade, quando os ovários carregam um número máximo de folículos antral. Assim, cordeiros de 4 semanas são considerados bons doadores, mesmo que a competência de desenvolvimento dos oócitos pré-púricionais seja menor em comparação com sua contraparte adulta.
Pesquisas básicas e aplicações comerciais seriam impulsionadas pela possibilidade de criopreservar oócitos vitrificados obtidos com sucesso tanto de doadores adultos quanto pré-púrias. A vitrificação do oócito coletado de doadores pré-púrias também permitiria encurtar o intervalo de geração e, assim, aumentar o ganho genético em programas de reprodução. No entanto, a perda do potencial de desenvolvimento após a criopreservação torna os oócitos mamíferos provavelmente um dos tipos de células mais difíceis de criopreservar. Entre as técnicas de criopreservação disponíveis, a vitrificação é amplamente aplicada aos oócitos animais e humanos. Apesar dos recentes avanços na técnica, exposições a altas concentrações de agentes crioprotetores, bem como lesões arrepiantes e estresse osmótico ainda induzem várias alterações estruturais e moleculares e reduzem o potencial de desenvolvimento dos oócitos mamíferos. Aqui, descrevemos um protocolo para a vitrificação de oócitos de ovelhas coletados de doadores juvenis e adultos e amadurecidos in vitro antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde oócito na maturação in vitro até o período de vitrificação, aquecimento e incubação pós-aquecimento. Os oócitos vitrificados na fase MII podem de fato ser fertilizados após o aquecimento, mas eles precisam de tempo extra antes da fertilização para restaurar os danos devido aos procedimentos criopreservadores e aumentar seu potencial de desenvolvimento. Assim, as condições e o tempo da cultura pós-aquecimento são passos cruciais para a restauração do potencial de desenvolvimento do oócito, especialmente quando o oócito é coletado de doadores juvenis.
Introduction
O armazenamento a longo prazo dos gametas femininos pode oferecer uma ampla gama de aplicações, como melhorar a reprodução animal doméstica por meio de programas de seleção genética, contribuir para preservar a biodiversidade através do programa de conservação de espécies de animais selvagens ex-situ, e impulsionar pesquisas e aplicações em biotecnologia in vitro graças à disponibilidade de oócitos armazenados a serem incorporados em programas de produção de embriões in vitro ou transplante nuclear1,2,3. A vitrificação de oócitos juvenis também aumentaria o ganho genético, encurtando o intervalo de geração nos programas de reprodução4. A vitrificação por resfriamento ultrarrápido e aquecimento de oócitos é atualmente considerada uma abordagem padrão para oócitos de pecuária criopreservação5. Em ruminantes, antes da vitrificação, os oócitos são geralmente amadurecidos in vitro, após a recuperação de folículos obtidos de ovários derivados do matadouro2. Ovários adultos, e especialmente pré-púbertos4,6, podem de fato fornecer um número praticamente ilimitado de oócitos para serem criopreservados.
No gado, após a vitrificação e oocito vitrificação e aquecimento, os rendimentos do blastocisto em >10% têm sido comumente relatados por vários laboratórios durante a última década3. No entanto, em pequenos ruminantes a vitrificação de oócitos ainda é considerada relativamente nova para os oócitos juvenis e adultos, e um método padrão para vitrificação de oócitos de ovelhas permanece a ser estabelecido2,5. Apesar dos avanços recentes, o oócito vitrificado e aquecido apresenta de fato várias alterações funcionais e estruturais que limitam seu potencial de desenvolvimento7,8,9. Assim, poucos artigos relataram o desenvolvimento de blastocistos em 10% ou mais em oócitos de ovelhas vitrificadas/aquecidas2. Várias abordagens têm sido investigadas para reduzir as alterações acima mencionadas: otimização da composição das soluções de vitrificação e descongelamento10,11; experimentando o uso de diferentes dispositivos criográficos8,12,13; e a aplicação de tratamentos específicos durante a maturação in vitro (IVM)4,14,15 e/ou durante o tempo de recuperação após o aquecimento6.
Aqui descrevemos um protocolo para a vitrificação de oócitos de ovelhas coletados de doadores juvenis e adultos e amadurecidos in vitro antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde oócito na maturação in vitro até o período de vitrificação, aquecimento e cultura pós-aquecimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A criopreservação de oócito em animais domésticos pode permitir não apenas a conservação a longo prazo dos recursos genéticos femininos, mas também avançar no desenvolvimento de biotecnologias embrionárias. Assim, o desenvolvimento de um método padrão de vitrificação oócito beneficiaria tanto a pecuária quanto o setor de pesquisa. Neste protocolo, é apresentado um método completo para vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e pode representar um ponto de partida sólido para o desenvolvimento de …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores não receberam nenhum financiamento específico para este trabalho. A professora Maria Grazia Cappai e a Dra.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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