Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden
Summary
Das Protokoll zielt darauf ab, eine Standardmethode für die Vitrifikation von erwachsenen und juvenilen Schafe eizellen bereitzustellen. Es umfasst alle Schritte von der Herstellung der In-vitro-Reifemedien bis zur Nacherwärmungskultur. Eizellen werden im MII-Stadium mit Cryotop vitrifiziert, um das minimale essentielle Volumen zu gewährleisten.
Abstract
In der Tierhaltung können In-vitro-Embryoproduktionssysteme dank der großen Anzahl von Eierstöcken und Eizellen, die leicht aus einem Schlachthof gewonnen werden können, entwickelt und aufrechterhalten werden. Erwachsene Eierstöcke tragen immer mehrere Antralfollikel, während bei präpubertären Spenderinnen die maximale Anzahl von Eizellen im Alter von 4 Wochen verfügbar ist, wenn eierstöcke Spitzenzahlen von Antralfollikeln tragen. So gelten 4 Wochen alte Lämmer als gute Spenderinnen, auch wenn die Entwicklungskompetenz präpubertärer Eizellen im Vergleich zu ihrem erwachsenen Pendant geringer ist.
Grundlagenforschung und kommerzielle Anwendungen würden durch die Möglichkeit der erfolgreichen Kryokonservierung von vitrifizierten Eizellen gefördert, die sowohl von erwachsenen als auch von präpubertären Spenderinnen gewonnen wurden. Die Vitrifikation von Eizellen, die von präpubertären Spenderinnen gesammelt wurden, würde auch eine Verkürzung des Erzeugungsintervalls und damit eine Erhöhung des genetischen Gewinns in Zuchtprogrammen ermöglichen. Der Verlust des Entwicklungspotenzials nach der Kryokonservierung macht Säugetier-Eizellen jedoch wahrscheinlich zu einem der am schwierigsten zu kryokonservierenden Zelltypen. Unter den verfügbaren Kryokonservierungstechniken wird die Vitrifikation häufig auf tierische und menschliche Eizellen angewendet. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Technik induzieren Expositionen gegenüber hohen Konzentrationen von Kryoprotektoren sowie kühlen Verletzungen und osmotischem Stress immer noch mehrere strukturelle und molekulare Veränderungen und reduzieren das Entwicklungspotenzial von Eizellen von Säugetieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigzellen, die von juvenilen und erwachsenen Spenderinnen entnommen und vor der Kryokonservierung in vitro gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung der Eizellen bis zur Vitrifikation, Erwärmung und Inkubationszeit nach der Erwärmung. Eizellen, die im MII-Stadium verglast wurden, können zwar nach der Erwärmung befruchtet werden, benötigen jedoch vor der Befruchtung zusätzliche Zeit, um Schäden durch Kryokonservierungsverfahren wiederherzustellen und ihr Entwicklungspotenzial zu erhöhen. Daher sind die Kulturbedingungen und der Zeitpunkt nach der Erwärmung entscheidende Schritte für die Wiederherstellung des Entwicklungspotenzials der Eizellen, insbesondere wenn Eizellen von juvenilen Spenderinnen entnommen werden.
Introduction
Die Langzeitlagerung der weiblichen Gameten kann eine breite Palette von Anwendungen bieten, wie z. B. die Verbesserung der Haustierzucht durch genetische Selektionsprogramme, den Beitrag zur Erhaltung der Biologischen Vielfalt durch das Ex-situ-Programm zum Schutz von Wildtierarten und die Förderung der Forschung und Anwendungen in der In-vitro-Biotechnologie dank der Verfügbarkeit von gelagerten Eizellen, die in die In-vitro-Embryonenproduktion oder Kerntransplantationsprogramme integriert werden können1,2,3. Die Vitrifikation juveniler Eizellen würde auch den genetischen Gewinn erhöhen, indem das Erzeugungsintervall in Zuchtprogrammen verkürzt wird4. Die Vitrifikation durch ultraschnelles Abkühlen und Erwärmen von Eizellen gilt derzeit als Standardansatz für die Kryokonservierung von Tierinnen5. Bei Wiederkäuern werden Eizellen vor der Vitrifikation in der Regel in vitro gereift, nachdem sie aus Follikeln gewonnen wurden, die aus Schlachthof-Eierstöcken gewonnen wurden2. Erwachsene und insbesondere präpubertäre Eierstöcke4,6, können in der Tat eine praktisch unbegrenzte Anzahl von Eizellen liefern, die kryokonserviert werden sollen.
Bei Rindern wurden nach Vitrifizierung und Erwärmung der Eizellen Blastozystenerträge von >10% in den letzten zehn Jahren häufig von mehreren Labors berichtet3. Bei kleinen Wiederkäuern gilt die Vitrifikation der Eizellen jedoch sowohl für juvenile als auch für erwachsene Eizellen noch als relativ neu, und eine Standardmethode für die Vitrifikation von Schaf-Eizellen muss noch festgelegt werden2,5. Trotz jüngster Fortschritte zeigt die vitrifizierte und erwärmte Eizelle tatsächlich mehrere funktionelle und strukturelle Veränderungen, die ihr Entwicklungspotenzial einschränken7,8,9. Daher haben nur wenige Artikel über eine Blastozystenentwicklung von 10% oder mehr in vitrifizierten/ erwärmten Schafse eizellenberichtet 2. Es wurden mehrere Ansätze untersucht, um die oben genannten Veränderungen zu reduzieren: Optimierung der Zusammensetzung der Vitrifikations- und Auftaulösungen10,11; Experimentieren mit der Verwendung verschiedener Kryo-Geräte8,12,13; und Anwendung spezifischer Behandlungen während der In-vitro-Reifung (IVM)4,14,15 und/oder während der Erholungszeit nach dem Erwärmen6.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigen, die von juvenilen und erwachsenen Spenderinnen gesammelt und vor der Kryokonservierung in vitro gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung der Eizellen bis zur Vitrifikation, Erwärmung und Kulturperiode nach der Erwärmung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kryokonservierung von Eizellen bei Haustieren kann nicht nur die langfristige Erhaltung weiblicher genetischer Ressourcen ermöglichen, sondern auch die Entwicklung embryonaler Biotechnologien vorantreiben. So würde die Entwicklung einer Standardmethode zur Vitrifikation von Eizellen sowohl der Nutztierhaltung als auch dem Forschungssektor zugute kämen. In diesem Protokoll wird eine vollständige Methode zur Vitrifikation von eizellten Erwachsenen schafen vorgestellt, die einen soliden Ausgangspunkt für die Entwic…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erhielten keine spezifische Förderung für diese Arbeit. Professor Maria Grazia Cappai und Dr. Valeria Pasciu sind dankbar für das Video-Voiceover und für den Aufbau des Labors während der Videoaufnahmen.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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