Vitrification d’ovocytes mûris in vitro prélevés sur des ovaires adultes et prépubéraux chez des moutons
Summary
Le protocole vise à fournir une méthode standard pour la vitrification des ovocytes de moutons adultes et juvéniles. Il comprend toutes les étapes de la préparation du milieu de maturation in vitro à la culture post-réchauffement. Les ovocytes sont vitrifiés au stade MII en utilisant Cryotop pour assurer le volume essentiel minimum.
Abstract
Chez le bétail, les systèmes de production d’embryons in vitro peuvent être développés et maintenus grâce au grand nombre d’ovaires et d’ovocytes qui peuvent être facilement obtenus à partir d’un abattoir. Les ovaires adultes portent toujours plusieurs follicules antraux, tandis que chez les donneurs pré-pubertaires, le nombre maximal d’ovocytes est disponible à l’âge de 4 semaines, lorsque les ovaires portent un nombre maximal de follicules antraux. Ainsi, les agneaux âgés de 4 semaines sont considérés comme de bons donneurs, même si la compétence développementale des ovocytes prépubéraux est inférieure à celle de leur homologue adulte.
La recherche fondamentale et les applications commerciales seraient stimulées par la possibilité de cryoconserver avec succès des ovocytes vitrifiés obtenus à partir de donneurs adultes et prépubères. La vitrification des ovocytes prélevés auprès de donneurs prépubéraux permettrait également de raccourcir l’intervalle de génération et ainsi d’augmenter le gain génétique dans les programmes de sélection. Cependant, la perte de potentiel de développement après cryoconservation fait des ovocytes de mammifères probablement l’un des types de cellules les plus difficiles à cryoconserver. Parmi les techniques de cryoconservation disponibles, la vitrification est largement appliquée aux ovocytes animaux et humains. Malgré les progrès récents de la technique, les expositions à des concentrations élevées d’agents cryoprotecteurs ainsi que les dommages de refroidissement et le stress osmotique induisent encore plusieurs changements structurels et moléculaires et réduisent le potentiel de développement des ovocytes de mammifères. Ici, nous décrivons un protocole pour la vitrification des ovocytes de moutons rassemblés des donateurs juvéniles et adultes et mûris in vitro avant cryopreservation. Le protocole comprend toutes les procédures allant de la maturation in vitro des ovocytes à la vitrification, au réchauffement et à la période d’incubation post-réchauffement. Les ovocytes vitrifiés au stade MII peuvent en effet être fécondés après réchauffement, mais ils ont besoin de plus de temps avant la fécondation pour restaurer les dommages dus aux procédures de cryoconservation et pour augmenter leur potentiel de développement. Ainsi, les conditions et le moment de la culture post-réchauffement sont des étapes cruciales pour la restauration du potentiel de développement des ovocytes, en particulier lorsque les ovocytes sont prélevés auprès de donneurs juvéniles.
Introduction
Le stockage à long terme des gamètes femelles peut offrir un large éventail d’applications, telles que l’amélioration de l’élevage d’animaux domestiques par des programmes de sélection génétique, la contribution à la préservation de la biodiversité grâce au programme ex situ de conservation des espèces sauvages, et la stimulation de la recherche et des applications biotechnologiques in vitro grâce à la disponibilité d’ovocytes stockés à incorporer dans la production d’embryons in vitro ou les programmes de transplantation nucléaire1,2,3. La vitrification des ovocytes juvéniles augmenterait également le gain génétique en raccourcissant l’intervalle de génération dans les programmes de sélection4. La vitrification par refroidissement et réchauffement ultra-rapides des ovocytes est actuellement considérée comme une approche standard pour la cryoconservation des ovocytes de bétail5. Chez les ruminants, avant la vitrification, les ovocytes sont généralement mûris in vitro, après récupération à partir de follicules obtenus à partir d’ovaires dérivés d’abattoirs2. Les ovaires adultes, et surtout prépubéraux4,6,peuvent en effet fournir un nombre quasi illimité d’ovocytes à cryoconserver.
Chez les bovins, après vitrification et réchauffement des ovocytes, des rendements en blastocystes à >10% ont été couramment rapportés par plusieurs laboratoires au cours de la dernière décennie3. Cependant, chez les petits ruminants, la vitrification des ovocytes est encore considérée comme relativement nouvelle pour les ovocytes juvéniles et adultes, et une méthode standard pour la vitrification des ovocytes des moutons reste à établir2,5. Malgré des avancées récentes, l’ovocyte vitrifié et réchauffé présente en effet plusieurs altérations fonctionnelles et structurelles qui limitent leur potentiel de développement 7,8,9. Ainsi, peu d’articles ont rapporté le développement de blastocystes à 10% ou plus dans les ovocytes de mouton vitrifiés/réchauffés2. Plusieurs approches ont été étudiées pour réduire les altérations précitées : optimisation de la composition des solutions de vitrification et de décongélation10,11; expérimenter l’utilisation de différents cryo-dispositifs8,12,13; et l’application de traitements spécifiques lors de la maturation in vitro (IVM)4,14,15 et/ou pendant le temps de récupération après réchauffement6.
Ici nous décrivons un protocole pour la vitrification des ovocytes de moutons rassemblés des donateurs juvéniles et adultes et mûris in vitro avant cryopreservation. Le protocole comprend toutes les procédures allant de la maturation in vitro des ovocytes à la vitrification, au réchauffement et à la période de culture post-réchauffement.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cryoconservation des ovocytes chez les animaux domestiques peut non seulement permettre la conservation à long terme des ressources génétiques féminines, mais aussi faire progresser le développement des biotechnologies embryonnaires. Ainsi, le développement d’une méthode standard pour la vitrification des ovocytes profiterait à la fois au bétail et au secteur de la recherche. Dans ce protocole, une méthode complète pour la vitrification adulte d’oocyte de mouton est présentée et pourrait représenter …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont reçu aucun financement spécifique pour ce travail. La professeure Maria Grazia Cappai et la Dre Valeria Pasciu sont reconnaissantes pour la voix off vidéo et pour la mise en place du laboratoire pendant la réalisation de la vidéo.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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