عزل الخلايا البطانية عن تجويف الشرايين السباتية للفئران لإجراء تجارب متعددة الخلايا أحادية الخلية
Summary
نقدم طريقة لعزل الخلايا البطانية والنوى عن تجويف الشرايين السباتية للفئران المعرضة لظروف تدفق مستقرة أو مضطربة لإجراء تجارب omics أحادية الخلية.
Abstract
تصلب الشرايين هو مرض التهابي في المناطق الشريانية المعرضة لتدفق الدم المضطرب (d-flow). ينظم D-flow التعبير عن الجينات في البطانة على مستويات النسخ وفوق الجينوم ، مما يؤدي إلى استجابات برواثيروجينيك. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) وفحص الخلية الواحدة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر Transposase (scATACseq) لتحديد تغييرات إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين بدقة خلية واحدة باستخدام نموذج ربط الشريان السباتي الجزئي للفأر (PCL). نظرا لأن الخلايا البطانية (ECs) تمثل جزءا صغيرا من إجمالي مجموعات الخلايا في جدار الشريان ، فقد تم استخدام طريقة هضم لمعانية للحصول على مستحضرات أحادية الخلية غنية ب EC. في هذه الدراسة ، خضعت الفئران لجراحة PCL للحث على تدفق D في الشريان السباتي الأيسر (LCA) أثناء استخدام الشريان السباتي الأيمن (RCA) كعنصر تحكم. تم تشريح الشرايين السباتية بعد يومين أو أسبوعين من جراحة PCL. تعرض تجويف كل سباتي لهضم الكولاجيناز ، وتم الحصول على خلايا مفردة غنية بالبطانة أو نوى واحدة. تم ترميز هذه المستحضرات أحادية الخلية وأحادية النوى في وقت لاحق باستخدام إعداد الموائع الدقيقة 10x Genomics. ثم تم استخدام الخلايا الأحادية المشفرة والنوى المفردة لإعداد الحمض النووي الريبي ، وتوليد المكتبة ، والتسلسل على جهاز تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية. بعد معالجة المعلوماتية الحيوية ، حددت مجموعات بيانات scRNAseq و scATACseq أنواعا مختلفة من الخلايا من الهضم المضيء ، والتي تتكون في المقام الأول من ECs. كانت خلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية والخلايا المناعية موجودة أيضا. ساعدت طريقة التخصيب EC هذه في فهم تأثير تدفق الدم على البطانة ، والتي كان من الممكن أن تكون صعبة مع طريقة هضم الشريان الكلي. يمكن استخدام طريقة تحضير الخلية الواحدة المخصب ب EC لإجراء دراسات omics أحادية الخلية في EC-knockouts والفئران المعدلة وراثيا حيث لم تتم دراسة تأثير تدفق الدم على هذه الجينات. الأهم من ذلك ، يمكن تكييف هذه التقنية لعزل الخلايا المفردة المخصب ب EC من الشريان البشري لإجراء دراسات ميكانيكية مماثلة.
Introduction
أثبت هذا المختبر سابقا أن تحريض تدفق D يؤدي إلى تطور تصلب الشرايين السريع والوعرة في الفئران شديدة الدهون 1,2. كان نموذج الفأر الجديد لتصلب الشرايين الناجم عن التدفق D ممكنا باستخدام جراحة ربط الشريان السباتي الجزئي (PCL) 3. تحفز جراحة PCL حالة تدفق الدم المنخفضة والمتذبذبة أو تدفق d في الشريان السباتي الأيسر المربوط (LCA). في المقابل، لا يزال الشريان السباتي الأيمن المقابل (RCA) يواجه تدفقا صفائحيا مستقرا (s-flow). في السابق ، لفهم تأثير تدفق D على الخلايا البطانية ، تم تشريح الشرايين السباتية بعد جراحة الربط الجزئي ومسحها بعامل تحلل قائم على الفينول والجوانيدين إيزوثيوسيانات (طريقة تدفق الحمض النووي الريبي / الحمض النووي) 2,4 ، والتي وفرت الحمض النووي الريبي “السائب المجمع” المخصب البطاني أو الحمض النووي. ثم تمت معالجة هذه الحمض النووي الريبي السائب المجمع أو الحمض النووي لدراسات النسخ أو دراسات ميثيلوم الحمض النووي فوق الجينومي ، على التوالي4،5،6. ساعدت هذه الدراسات في اكتشاف العديد من الجينات الحساسة للتدفق والحمض النووي الريبي الميكروي الذي تم التحقيق على نطاق واسع في أدواره في البيولوجيا البطانية وتصلب الشرايين4،6،7.
ومع ذلك ، على الرغم من التخصيب البطاني ، لم تتمكن دراسات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي السائبة هذه من التمييز بين الدور المحدد لكل نوع من الخلايا في جدار الشريان في تصلب الشرايين الناجم عن التدفق D. تم إجراء عزل الخلية الواحدة المخصب البطاني (sc) ودراسات تسلسل scRNA و scATAC للتغلب على هذا القيد8. لهذا ، خضعت الفئران C57Bl6 لجراحة PCL للحث على تدفق d في LCA أثناء استخدام RCA المكشوف للتدفق s كعنصر تحكم. بعد يومين أو أسبوعين من جراحة PCL ، تم التضحية بالفئران ، وتم تشريح السباتيدات وتنظيفها. تم غرس تجويف كل من LCAs و RCAs مع الكولاجيناز ، وتم جمع هضمات الكولاجيناز المضيئة التي تحتوي على ECs كجزء كبير والخلايا الشريانية الأخرى. تم إعداد التعليق أحادي الخلية (scRNAseq) أو التعليق أحادي النواة (scATACseq) وتم ترميزه بمعرفات فريدة لكل خلية أو نواة باستخدام إعداد 10x Genomics. تم إخضاع الحمض النووي الريبي لإعداد مكتبة cDNA وتسلسلها.
تمت معالجة مجموعات بيانات scRNAseq و scATACseq باستخدام برنامج Cell Ranger أحادي الخلية وتم تحليلها بشكل أكبر بواسطة حزم Seurat و Signac R 9,10. تم تعيين نوع خلية لكل خلية ونواة من هذه التحليلات وتم تجميعها في نوع الخلية بناء على جينات العلامات وأنماط التعبير الجيني الفريدة. أظهرت نتائج scRNAseq و scATACseq أن هذه المستحضرات أحادية الخلية غنية ب ECs وتحتوي أيضا على خلايا العضلات الملساء (SMCs) والخلايا الليفية والخلايا المناعية.
وكشف مزيد من التحليل أن مجموعة EC في عملية الهضم المضيئة متباعدة للغاية وبلاستيكية (8 مجموعات EC مختلفة) وتستجيب لتدفق الدم. الأهم من ذلك ، أظهرت هذه النتائج أن تدفق D يعيد برمجة ECs من النمط الظاهري المضاد للالتهابات المحمي من الثيرو إلى الأنماط الظاهرية المؤيدة لتصلب الشرايين ، بما في ذلك الانتقال المؤيد للالتهابات ، والانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة ، وانتقال الخلايا الجذعية / السلفية البطانية ، والأكثر إثارة للدهشة ، الانتقال الشبيه بالخلية البطانية إلى المناعة. بالإضافة إلى ذلك، تكشف بيانات scATACseq عن تغييرات جديدة في إمكانية الوصول إلى الكروماتين تعتمد على التدفق ومواقع ربط عامل النسخ بطريقة على نطاق الجينوم، والتي تشكل الأساس للعديد من الفرضيات الجديدة. منهجية وبروتوكول إعداد الخلايا البطانية المفردة للدراسات متعددة الخلايا أحادية الخلية من الشرايين السباتية للفأر مفصلة أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لعزل مستحضرات الخلية الواحدة عن الشرايين السباتية للفأر. يمكن دراسة تأثير تدفق D على الخلايا البطانية بدقة إذا تم إجراء جراحة PCL بشكل صحيح. من الأهمية بمكان تحديد فروع الشريان السباتي الشائع بشكل صحيح ، مثل الشريان السباتي الخارجي والسباتي الداخلي وال?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بتمويل من منح المعاهد الوطنية للصحة HL119798 و HL095070 و HL139757 إلى HJ. يتم دعم HJ أيضا من قبل Wallace H. Coulter Distinguished College Chair Professorship. تم دعم الخدمات التي تقدمها إيموري المتكاملة لعلم الجينوم الأساسي (EIGC) من قبل كلية الطب بجامعة إيموري وتم دعمها جزئيا من قبل تحالف جورجيا للعلوم السريرية والانتقالية التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم. UL1TR002378. المحتوى المقدم أعلاه هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يعكس وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Referenzen
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O’Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
