Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten
Summary
We presenteren een methode voor het isoleren van endotheelcellen en kernen uit het lumen van muiscarotisslagaders die zijn blootgesteld aan stabiele of verstoorde stroomomstandigheden om eencellige omics-experimenten uit te voeren.
Abstract
Atherosclerose is een ontstekingsziekte van de arteriële gebieden die worden blootgesteld aan een verstoorde bloedstroom (d-flow). D-flow reguleert de expressie van genen in het endotheel op transcriptomisch en epigenomisch niveau, wat resulteert in proatherogene responsen. Onlangs werden single-cell RNA sequencing (scRNAseq) en single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies uitgevoerd om de transcriptomische en chromatine toegankelijkheidsveranderingen te bepalen bij een single-cell resolutie met behulp van het muis partiële carotis ligatie (PCL) model. Aangezien endotheelcellen (EC’s) een klein deel van de totale celpopulaties in de slagaderwand vertegenwoordigen, werd een luminale verteringsmethode gebruikt om EC-verrijkte eencellige preparaten te verkrijgen. Voor deze studie werden muizen onderworpen aan PCL-chirurgie om d-flow in de linker halsslagader (LCA) te induceren terwijl de rechter halsslagader (RCA) als controle werd gebruikt. De halsslagaders werden twee dagen of twee weken na de PCL-operatie ontleed. Het lumen van elke halsslagader werd onderworpen aan collagenasevertering en endotheelverrijkte enkele cellen of enkele kernen werden verkregen. Deze eencellige en eenkernige preparaten werden vervolgens gecodeerd met behulp van een 10x Genomics microfluïdische opstelling. De single-cells en single-nuclei met streepjescode werden vervolgens gebruikt voor RNA-voorbereiding, bibliotheekgeneratie en sequencing op een HIGH-throughput DNA-sequencer. Na de verwerking van bioinformatica identificeerden de datasets scRNAseq en scATACseq verschillende celtypen uit de luminale vertering, voornamelijk bestaande uit EC’s. Gladde spiercellen, fibroblasten en immuuncellen waren ook aanwezig. Deze EC-verrijkingsmethode hielp bij het begrijpen van het effect van de bloedstroom op het endotheel, wat moeilijk had kunnen zijn met de totale slagaderverteringsmethode. De EC-verrijkte eencellige bereidingsmethode kan worden gebruikt om eencellige omics-studies uit te voeren bij EC-knock-outs en transgene muizen waarbij het effect van de bloedstroom op deze genen niet is bestudeerd. Belangrijk is dat deze techniek kan worden aangepast om EC-verrijkte enkele cellen te isoleren van menselijke arterie-explantaten om vergelijkbare mechanistische studies uit te voeren.
Introduction
Dit laboratorium toonde eerder aan dat inductie van d-flow leidt tot snelle en robuuste atheroscleroseontwikkeling bij hyperlipidemische muizen 1,2. Het nieuwe muismodel van d-flow-geïnduceerde atherosclerose was mogelijk met behulp van partiële carotisligatie (PCL) chirurgie 3. PCL-chirurgie induceert een lage en oscillerende bloedstroomconditie of d-flow in de ligatie linker halsslagader (LCA). Daarentegen blijft de contralaterale rechter halsslagader (RCA) te maken hebben met een stabiele laminaire stroming (s-flow). Om het effect van d-flow op endotheelcellen te begrijpen, werden de halsslagaders eerder na een gedeeltelijke ligatieoperatie ontleed en gespoeld met een op fenol en guanidine isothiocyanaat gebaseerd lysingmiddel (luminale RNA / DNA-spoelmethode)2,4, die endotheelverrijkte “gepoolde bulk” RNA’s of DNA’s leverden. Deze gepoolde bulk-RNA’s of DNA’s werden vervolgens verwerkt voor transcriptomische studies of epigenomische DNA-methyloomstudies, respectievelijk 4,5,6. Deze studies hielpen bij het ontdekken van meerdere stroomgevoelige genen en microRNA’s waarvan de rol in endotheelbiologie en atherosclerose uitgebreid werd onderzocht 4,6,7.
Ondanks endotheelverrijking konden deze bulk RNA/ DNA-studies echter niet de specifieke rol van elk celtype in de slagaderwand onderscheiden bij d-flow-geïnduceerde atherosclerose. Endotheelverrijkte eencellige (sc) isolatie en scRNA- en scATAC-sequencingstudies werden uitgevoerd om deze beperking te overwinnen8. Hiervoor werden C57Bl6-muizen onderworpen aan de PCL-operatie om d-flow in de LCA te induceren terwijl de s-flow-blootgestelde RCA als controle werd gebruikt. Twee dagen of twee weken na de PCL-operatie werden de muizen geofferd en werden de halsslagaders ontleed en opgeruimd. Het lumen van zowel LCA’s als RCA’s werd doordrenkt met collagenase en de luminale collagenase-digesten die EC’s bevatten als een significante fractie en andere arteriële cellen werden verzameld. De single-cell suspension (scRNAseq) of single-nuclei suspensie (scATACseq) werden voorbereid en voorzien van barcodes met unieke identifiers voor elke cel of kern met behulp van een 10x Genomics setup. De RNA’s werden onderworpen aan cDNA-bibliotheekvoorbereiding en gesequenced.
De scRNAseq en scATACseq datasets werden verwerkt met behulp van de Cell Ranger Single-Cell Software en verder geanalyseerd door Seurat en Signac R pakketten 9,10. Elke cel en kern kreeg een celtype toegewezen uit deze analyses en geclusterd in het celtype op basis van de markergenen en unieke genexpressiepatronen. De resultaten van de scRNAseq en scATACseq toonden aan dat deze eencellige preparaten verrijkt zijn met EC’s en ook gladde spiercellen (SMC’s), fibroblasten en immuuncellen bevatten.
Verdere analyse toonde aan dat de EG-populatie in de luminale vertering zeer divergent en plastisch is (8 verschillende EC-clusters) en reageert op de bloedstroom. Het belangrijkste is dat deze resultaten aantoonden dat d-flow EC’s herprogrammeert van een athero-beschermd ontstekingsremmend fenotype naar pro-atherogene fenotypen, waaronder pro-inflammatoire, endotheel-naar-mesenchymale overgang, endotheelstam / voorlopercelovergang en het meest verrassend, endotheel-naar-immuuncelachtige overgang. Bovendien onthullen scATACseq-gegevens nieuwe stroomafhankelijke chromatinetoegankelijkheidsveranderingen en transcriptiefactorbindingsplaatsen op een genoombrede manier, die de basis vormen van verschillende nieuwe hypothesen. De methodologie en het protocol voor het voorbereiden van enkelvoudige endotheelcellen voor eencellige multi-omics-studies van de muiscarotisslagaders worden hieronder beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om eencellige preparaten te isoleren uit de halsslagaders van de muis. De invloed van d-flow op de endotheelcellen kan nauwkeurig worden bestudeerd als de PCL-operatie correct wordt uitgevoerd. Het is cruciaal om de takken van de gemeenschappelijke halsslagader correct te identificeren, zoals de externe halsslagader, interne halsslagader, occipitale slagader en superieure schildklierslagader. Validatie van stromingspatronen door echografie valideert verder het succesv…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van national institutes of health subsidies HL119798, HL095070 en HL139757 aan HJ. HJ wordt ook ondersteund door het Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. De diensten van de Emory Integrated Genomics Core (EIGC) werden gesubsidieerd door de Emory University School of Medicine en werden ook gedeeltelijk ondersteund door de Georgia Clinical and Translational Science Alliance van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer. UL1TR002378. De hierboven verstrekte inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelt niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Referenzen
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O’Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
