シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離
Summary
我々は、1細胞オミクス実験を行うために、安定したまたは乱れた流動条件にさらされたマウス頸動脈の内腔から内皮細胞および核を単離する方法を提示する。
Abstract
アテローム性動脈硬化症は、血流障害(d-flow)にさらされる動脈領域の炎症性疾患です。 D-flow は、内皮における遺伝子の発現をトランスクリプトームおよびエピゲノムレベルで調節し、動脈硬化促進反応をもたらす。最近、マウス部分頸動脈結紮(PCL)モデルを使用して、トランスクリプトミクスおよびクロマチンアクセシビリティの変化を単一細胞分解能で決定するために、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)およびシングルセルアッセイフォートランスポザーゼアクセスクロマチンシーケンシング(scATACseq)研究が実施されました。内皮細胞(EC)は動脈壁の全細胞集団のごく一部であるため、管腔消化法を使用してEC濃縮シングルセル製剤を入手しました。この研究では、マウスは、右頸動脈(RCA)を対照として使用しながら、左頸動脈(LCA)に d-flow を誘導するPCL手術を受けました。頸動脈はPCL手術の2日後または2週間後に解剖されました。各頸動脈の内腔にコラゲナーゼ消化を行い、内皮濃縮単一細胞または単一核を得た。これらの単一細胞および単一核調製物は、続いて10倍ゲノミクスマイクロ流体セットアップを使用してバーコード化されました。次に、バーコード化された単一細胞と単一核を、ハイスループットDNAシーケンサーでのRNA調製、ライブラリ生成、およびシーケンシングに利用しました。バイオインフォマティクス処理後、scRNAseqおよびscATACseqデータセットは、主にECからなる管腔消化からさまざまな細胞タイプを同定しました。平滑筋細胞、線維芽細胞、および免疫細胞も存在した。このEC濃縮法は、全動脈消化法では困難であった内皮に対する血流の影響を理解するのに役立ちました。EC濃縮シングルセル調製法は、これらの遺伝子に対する血流の影響が研究されていないECノックアウトおよびトランスジェニックマウスにおけるシングルセルオミクス研究を行うために使用できます。重要なことに、この技術は、同様の機構研究を行うために、ヒト動脈外植片からEC濃縮単一細胞を単離するように適合させることができる。
Introduction
この研究室は以前、d-flowの誘導が高脂血症マウスの迅速かつ頑丈なアテローム性動脈硬化症の発症につながることを実証しました1,2。dフロー誘発性アテローム性動脈硬化症の新しいマウスモデルは、部分頸動脈結紮(PCL)手術を使用して可能でした3。PCL手術は、結紮された左頸動脈(LCA)に低振動血流状態またはdフローを誘発します。対照的に、反対側の右頸動脈(RCA)は安定した層流(s流)に直面し続けています。以前は、内皮細胞に対するd-flowの影響を理解するために、部分結紮手術後に頸動脈を解剖し、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートベースの溶解剤(管腔RNA/DNAフラッシング法)2,4で洗い流し、内皮に富む「プールバルク」RNAまたはDNAを提供しました。次に、これらのプールされたバルクRNAまたはDNAを、トランスクリプトーム研究またはエピゲノムDNAメチローム研究のためにそれぞれ処理した4、5、6。これらの研究は、内皮生物学とアテローム性動脈硬化症における役割が広範囲に調査された複数の流れ感受性遺伝子とマイクロRNAを発見するのに役立ちました4,6,7。
しかし、内皮濃縮にもかかわらず、これらのバルクRNA/DNA研究は、d-flow誘発性アテローム性動脈硬化症における動脈壁における各細胞タイプの特定の役割を区別することができなかった。この制限を克服するために、内皮濃縮単一細胞(sc)単離およびscRNAおよびscATACシーケンシング研究を実施しました8。このために、C57Bl6マウスは、コントロールとしてsフロー曝露RCAを使用しながら、LCAにdフローを誘導するためのPCL手術を受けました。PCL手術の2日または2週間後、マウスを屠殺し、頸動脈を解剖してクリーンアップしました。LCAとRCAの両方の内腔にコラゲナーゼを注入し、ECを有意な画分として含む管腔コラゲナーゼ消化物および他の動脈細胞を採取した。シングルセル懸濁液(scRNAseq)またはシングルヌクレイ懸濁液(scATACseq)を調製し、10倍ゲノミクスセットアップを使用して各細胞または核の一意の識別子でバーコード化しました。RNAをcDNAライブラリー調製に供し、配列決定した。
scRNAseqおよびscATACseqデータセットは、Cell Ranger Single-Cell Softwareを使用して処理され、SeuratおよびSignac Rパッケージ9,10によってさらに分析された。各細胞と核には、これらの分析から細胞タイプが割り当てられ、マーカー遺伝子と固有の遺伝子発現パターンに基づいて細胞タイプにクラスター化されました。scRNAseqおよびscATACseqの結果は、これらの単一細胞調製物がECで濃縮され、平滑筋細胞(SMC)、線維芽細胞、および免疫細胞も含むことを示しました。
さらなる分析により、管腔消化におけるEC集団は非常に発散的で可塑性(8つの異なるECクラスター)であり、血流に反応することが明らかになりました。最も重要なことは、これらの結果は、 d-flow がECをアテロームで保護された抗炎症表現型から、炎症誘発性、内皮から間葉系への移行、内皮幹/前駆細胞への移行、そして最も驚くべきことに内皮から免疫細胞への移行を含むアテローム誘発性表現型に再プログラムすることを示しました。さらに、scATACseqデータは、新しいフロー依存性のクロマチンアクセシビリティの変化と転写因子結合部位をゲノムワイドに明らかにし、いくつかの新しい仮説の基礎を形成します。マウス頸動脈から単一細胞マルチオミクス研究のための単一内皮細胞を調製するための方法論とプロトコルを以下に詳述します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文は、マウス頸動脈から単一細胞製剤を単離するための詳細なプロトコルを提供します。PCL手術が正しく行われれば、内皮細胞に対する d-flow の影響を正確に研究することができます。外頸動脈、内頸動脈、後頭動脈、上甲状腺動脈など、一般的な頸動脈の枝を正しく識別することが重要です。超音波検査によるフローパターンの検証は、 dフロー 条件の正常な発症をさ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所からの助成金HL119798、HL095070、およびHL139757からのHJへの資金提供によってサポートされました。HJは、ウォレスH.コールター特別教授の教授職によってもサポートされています。エモリー統合ゲノミクスコア(EIGC)によって提供されるサービスは、エモリー大学医学部によって助成され、また、賞番号の下で国立衛生研究所のジョージア臨床およびトランスレーショナルサイエンスアライアンスによって部分的にサポートされました。UL1TR002378。上記の内容は著者の責任であり、国立衛生研究所の公式見解を反映したものではありません。
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Referenzen
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O’Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
