Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares
Summary
Presentamos un método para aislar células endoteliales y núcleos de la luz de arterias carótidas de ratón expuestas a condiciones de flujo estables o alteradas para realizar experimentos ómicos unicelulares.
Abstract
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria de las regiones arteriales expuestas a un flujo sanguíneo alterado (flujo d). El flujo D regula la expresión de genes en el endotelio a nivel transcriptómico y epigenómico, dando lugar a respuestas proaterogénicas. Recientemente, se realizaron estudios de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y ensayo de células individuales para secuenciación de cromatina accesible por transposasa (scATACseq) para determinar los cambios transcriptómicos y de accesibilidad a la cromatina a una resolución de una sola célula utilizando el modelo de ligadura carotídea parcial (PCL) de ratón. Como las células endoteliales (CE) representan una fracción menor de las poblaciones celulares totales en la pared arterial, se utilizó un método de digestión luminal para obtener preparaciones unicelulares enriquecidas con EC. Para este estudio, los ratones fueron sometidos a cirugía de LCP para inducir el flujo d en la arteria carótida izquierda (LCA) mientras usaban la arteria carótida derecha (RCA) como control. Las arterias carótidas se diseccionaron dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP. La luz de cada carótida se sometió a la digestión de colagenasa, y se obtuvieron células individuales enriquecidas endotelialmente o núcleos únicos. Estas preparaciones de una sola célula y de un solo núcleo se codificaron posteriormente utilizando una configuración microfluídica de Genomics 10x. Las células individuales y núcleos únicos con código de barras se utilizaron para la preparación de ARN, la generación de bibliotecas y la secuenciación en un secuenciador de ADN de alto rendimiento. Después del procesamiento bioinformático, los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq identificaron varios tipos de células de la digestión luminal, que consisten principalmente en CE. Las células musculares lisas, los fibroblastos y las células inmunes también estaban presentes. Este método de enriquecimiento de EC ayudó a comprender el efecto del flujo sanguíneo en el endotelio, lo que podría haber sido difícil con el método de digestión arterial total. El método de preparación de células individuales enriquecido con CE se puede utilizar para realizar estudios ómicos de células individuales en ratones EC-knockouts y transgénicos donde no se ha estudiado el efecto del flujo sanguíneo sobre estos genes. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar para aislar células individuales enriquecidas con CE de explantes de arterias humanas para realizar estudios mecanicistas similares.
Introduction
Este laboratorio demostró previamente que la inducción del flujo d conduce al desarrollo rápido y robusto de aterosclerosis en ratones hiperlipidémicos 1,2. El nuevo modelo de ratón de aterosclerosis inducida por flujo D fue posible mediante cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP) 3. La cirugía de LCP induce una condición de flujo sanguíneo bajo y oscilatorio o flujo D en la arteria carótida izquierda ligada (LCA). En contraste, la arteria carótida derecha contralateral (ACR) continúa enfrentando un flujo laminar estable (flujo s). Anteriormente, para comprender el efecto del flujo d en las células endoteliales, las arterias carótidas se diseccionaron después de la cirugía de ligadura parcial y se enjuagaron con un agente lisante a base de isotiocianato de fenol y guanidina (método de lavado de ARN / ADN luminal)2,4, que proporcionó ARN o ADN enriquecidos endotelialmente “agrupados”. Estos ARN o ADN a granel agrupados se procesaron para estudios transcriptómicos o estudios de metiloma de ADN epigenómico, respectivamente 4,5,6. Estos estudios ayudaron a descubrir múltiples genes sensibles al flujo y microARN cuyos roles en la biología endotelial y la aterosclerosis fueron ampliamente investigados 4,6,7.
Sin embargo, a pesar del enriquecimiento endotelial, estos estudios masivos de ARN / ADN no pudieron distinguir el papel específico de cada tipo de célula en la pared arterial en la aterosclerosis inducida por flujo d. Para superaresta limitación se realizó aislamiento unicelular (sc) enriquecido endotelial y estudios de secuenciación de scRNA y scATAC 8. Para esto, los ratones C57Bl6 fueron sometidos a la cirugía PCL para inducir el flujo d en el LCA mientras usaban el RCA expuesto al flujo s como control. Dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP, los ratones fueron sacrificados, y las carótidas fueron diseccionadas y limpiadas. La luz de los ACV y los ACR se infundió con colagenasa, y se recogieron los digeridos luminales de colagenasa que contenían CE como una fracción significativa y otras células arteriales. La suspensión de una sola célula (scRNAseq) o la suspensión de un solo núcleo (scATACseq) se prepararon y codificaron con códigos de barras con identificadores únicos para cada célula o núcleo utilizando una configuración genómica 10x. Los ARN se sometieron a la preparación de la biblioteca de ADNc y se secuenciaron.
Los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq se procesaron utilizando el software Cell Ranger Single-Cell y se analizaron posteriormente mediante los paquetes Seurat y Signac R 9,10. A cada célula y núcleo se le asignó un tipo de célula de estos análisis y se agrupó en el tipo de célula en función de los genes marcadores y los patrones de expresión génica únicos. Los resultados de scRNAseq y scATACseq demostraron que estas preparaciones unicelulares están enriquecidas con CE y también contienen células musculares lisas (SMC), fibroblastos y células inmunes.
Un análisis posterior reveló que la población de EC en la digestión luminal es altamente divergente y plástica (8 grupos diferentes de EC) y responde al flujo sanguíneo. Lo más importante es que estos resultados demostraron que el flujo d reprograma los CE de un fenotipo antiinflamatorio protegido por atero a fenotipos proaterogénicos, incluida la transición proinflamatoria, endotelial a mesenquimal, la transición de células madre / progenitoras endoteliales y, lo que es más sorprendente, la transición de células endoteliales a inmunes. Además, los datos de scATACseq revelan nuevos cambios de accesibilidad a la cromatina dependientes del flujo y sitios de unión al factor de transcripción de una manera genómica completa, que forman la base de varias hipótesis nuevas. La metodología y el protocolo para preparar células endoteliales individuales para estudios multiómicos unicelulares de las arterias carótidas de ratón se detallan a continuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este documento proporciona un protocolo detallado para aislar preparaciones unicelulares de las arterias carótidas del ratón. La influencia del flujo d en las células endoteliales se puede estudiar con precisión si la cirugía de LCP se realiza correctamente. Es crucial identificar correctamente las ramas de la carótida común, como la carótida externa, la carótida interna, la arteria occipital y la arteria tiroidea superior. La validación de los patrones de flujo por ecografía valida aún más el inici…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL119798, HL095070 y HL139757 a HJ. HJ también cuenta con el apoyo de la cátedra Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chairship. Los servicios prestados por el Emory Integrated Genomics Core (EIGC) fueron subvencionados por la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory y también fueron apoyados en parte por la Alianza de Ciencias Clínicas y Traslacionales de Georgia de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio No. UL1TR002378. El contenido proporcionado anteriormente es responsabilidad exclusiva de los autores y no refleja las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Referenzen
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