التصوير المتزامن والكشف القائم على قياس التدفق الخلوي لعلامات الشيخوخة الفلورية المتعددة في الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج
Summary
نقدم هنا طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي للتصور والقياس الكمي للعلامات المتعددة المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا المفردة.
Abstract
يمكن أن تحفز أدوية العلاج الكيميائي تلف الحمض النووي الذي لا يمكن إصلاحه في الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج أو الشيخوخة المبكرة. على عكس موت الخلايا الماصة ، فإن الشيخوخة هي آلية مختلفة اختلافا جوهريا تقيد انتشار الخلايا السرطانية. كشفت عقود من الدراسات العلمية عن الآثار المرضية المعقدة للخلايا السرطانية الشائخة في الأورام والبيئات الدقيقة التي تعدل الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية. تشير الأدلة الجديدة إلى أن الشيخوخة هي عامل تنبؤ قوي أثناء علاج السرطان ، وبالتالي فإن الكشف السريع والدقيق عن الخلايا الشائخة في عينات السرطان أمر ضروري. تقدم هذه الورقة طريقة لتصور واكتشاف الشيخوخة الناجمة عن العلاج (TIS) في الخلايا السرطانية. عولجت خطوط الخلايا اللمفاوية الكبيرة المنتشرة بالخلايا البائية (DLBCL) باستخدام المافوسفاميد (MAF) أو الدونوروبيسين (DN) وتم فحصها بحثا عن علامة الشيخوخة ، β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) ، وعلامة تخليق الحمض النووي 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، وعلامة تلف الحمض النووي gamma-H2AX (γH2AX). يمكن أن يساعد تصوير مقياس التدفق الخلوي في توليد صور أحادية الخلية عالية الدقة في فترة زمنية قصيرة لتصور العلامات الثلاثة في الخلايا السرطانية وتحديدها كميا في وقت واحد.
Introduction
يمكن لمجموعة متنوعة من المحفزات أن تؤدي إلى الشيخوخة الخلوية، مما يتسبب في دخول الخلايا في حالة من توقف دورة الخلية المستقرة. وتشمل هذه المحفزات تغييرات الإشارات الجوهرية أو الضغوط الخارجية. تشمل الإشارات الجوهرية تقصير التيلومير التدريجي ، والتغيرات في بنية التيلومير ، والتعديل اللاجيني ، واضطرابات البروتيوستاسيس ، وخلل الميتوكوندريا ، وتنشيط الجينات الورمية. تشمل الضغوط الخارجية إشارات تلف الالتهاب و / أو الأنسجة ، والإشعاع أو العلاج الكيميائي ، والحرمان الغذائي1،2،3،4. من بين الأنواع المتميزة من الشيخوخة ، فإن الأكثر شيوعا والمدروسة جيدا هي الشيخوخة التكرارية ، والشيخوخة التي يسببها الجين الورمي (OIS) ، والشيخوخة الناجمة عن الإشعاع ، والشيخوخة الناجمة عن العلاج (TIS). OIS هي استجابة خلوية حادة للأضرار السامة الجينية الناجمة عن الإجهاد التكراري الناتج عن تنشيط الجينات الورمية الشاذة ويمكن أن تمنع إلى حد ما التقدم المرضي من آفة ما قبل الورم إلى ورم كامل. يحدث TIS عندما يتم الضغط على الخلايا السرطانية بواسطة أدوية العلاج الكيميائي أو الإشعاع المؤين 5,6.
يعتبر الشيخوخة سيفا ذا حدين في علم الأمراض بسبب طبيعته الديناميكية للغاية. تم وصفه في البداية بأنه آلية مفيدة لقمع الورم لإزالة الخلايا التالفة من المجموعة المنتشرة للخلايا المنقسمة ، وحماية الوظيفة الطبيعية للأعضاء وتثبيط نمو الورم7،8،9. ومع ذلك ، فقد أشارت الأدلة الناشئة إلى جانب مظلم من الشيخوخة. تفرز الخلايا الشائخة السيتوكينات الالتهابية ، والمعروفة باسم النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) ، مما يؤدي إلى التليف والأعضاء غير الوظيفية ويعزز بدء الورم وتقدمه10. علاوة على ذلك، تخضع الخلايا السرطانية الشائخة لإعادة برمجة الجينات والتعبير الجيني بالتوازي مع إعادة تشكيل الكروماتين وتنشيط استجابة مستمرة لتلف الحمض النووي (DDR)11،12، واكتساب خصائص جديدة للخلايا السرطانية الجذعية3. على الرغم من أن الأورام القادرة على الشيخوخة تستجيب بشكل أفضل للتدخل العلاجي مقارنة بالأورام غير القادرة على الشيخوخة13 ، إلا أن استمرار الخلايا الشائخة قد يؤدي إلى سوء التشخيص على المدى الطويل إذا لم يتم تحديدها والقضاء عليها بشكل فعال بواسطة الأدوية المحلل للسينوليك5. في كلتا الحالتين ، فإن الطريقة الموثوقة لتقييم الشيخوخة ذات أهمية سريرية كبيرة ، ليس فقط لتشخيص العلاج العلاجي ولكن أيضا لتطوير استراتيجيات جديدة تستهدف الخلايا الشائخة.
بغض النظر عن المحفزات المختلفة ، تظهر الخلايا الشائخة بعض السمات الشائعة ، بما في ذلك التشكل الموسع والمسطح ومتعدد النوى مع فجوات كبيرة ، ونوى موسعة بشكل كبير ، وتشكيل هيتيروكروماتين مرتبط بالشيخوخة H3K9me3 (SAHF) في النواة ، والتراكم المستمر لعلامات تلف الحمض النووي γH2AX البؤر ، وتنشيط p53-p21CIP1 و Rb-p16INK4a الآليات التنظيمية لدورة الخلية ، والقبض على دورة الخلية G1 المستقرة ، والحث الهائل ل SASP ، ونشاط β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal)14. نظرا لعدم وجود علامة واحدة كافية لتحديد الشيخوخة ، فإن التلطيخ الأنزيمي لنشاط SA-β-gal ، والذي يعتبر المعيار الذهبي للكشف عن الشيخوخة ، عادة ما يتم دمجه مع تلطيخ كيميائي نسيجي مناعي ل H3K9me3 و Ki67 للكشف عن TIS15. ومع ذلك ، من الصعب تحديد SA-β-gal القائم على الكروموجينيك الكيميائي. هنا ، قمنا بدمج 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) للكشف عن SA-β-gal القائم على التألق (fSA-β-gal) مع تلطيخ الفلورسنت المناعي ل γH2AX و EdU-incorporated DNA لتحديد الخلايا الشائخة C12FDG + EdU-γH2AX + باستخدام نظام مقياس التدفق الخلوي المتقدم للتصوير ، والذي يجمع بين السرعة والحساسية والصور التفصيلية أحادية الخلية مع المعلومات المكانية التي لا يمكن توفيرها عن طريق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري. تتيح هذه الطريقة التوليد السريع للصور عالية الدقة مما يسمح بتحديد مواقع إشارات الفلورسنت وتحديدها كميا داخل الخلايا ، مع ترخيص التحليل السريع لعينات متعددة من خلال بناء خطوط أنابيب قياسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحصت هذه الطريقة القدرة على دخول الشيخوخة لأربعة خطوط مختلفة من خلايا DLBCL عند العلاج الكيميائي ، مع التصوير الساطع المجال والقياس الكمي القائم على التدفق الخلوي. على مستوى الخلية الواحدة، نجحنا في اكتشاف المجموعات السكانية الشائخة الرئيسية C12FDG+EdU-Ki67+ في خلايا KARPAS422 وWSU-DLCL…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة إلى يونغ يو من جامعة يوهانس كيبلر لينز (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
Referenzen
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
