Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia
Summary
Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.
Abstract
Los medicamentos quimioterapéuticos pueden inducir daños irreparables en el ADN en las células cancerosas, lo que lleva a la apoptosis o senescencia prematura. A diferencia de la muerte celular apoptótica, la senescencia es una maquinaria fundamentalmente diferente que restringe la propagación de las células cancerosas. Décadas de estudios científicos han revelado los complejos efectos patológicos de las células cancerosas senescentes en tumores y microambientes que modulan las células cancerosas y las células estromales. La nueva evidencia sugiere que la senescencia es un potente factor pronóstico durante el tratamiento del cáncer y, por lo tanto, la detección rápida y precisa de las células senescentes en muestras de cáncer es esencial. Este artículo presenta un método para visualizar y detectar la senescencia inducida por la terapia (TIS) en las células cancerosas. Las líneas celulares de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) se trataron con mafosfamida (MAF) o daunorrubicina (DN) y se examinaron para detectar el marcador de senescencia, la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal), el marcador de síntesis de ADN 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y el marcador gamma-H2AX de daño al ADN (γH2AX). Las imágenes del citómetro de flujo pueden ayudar a generar imágenes unicelulares de alta resolución en un corto período de tiempo para visualizar y cuantificar simultáneamente los tres marcadores en las células cancerosas.
Introduction
Una variedad de estímulos puede desencadenar la senescencia celular, haciendo que las células entren en un estado de detención estable del ciclo celular. Estos estímulos incluyen cambios intrínsecos de señalización o tensiones extrínsecas. Las señales intrínsecas incluyen acortamiento progresivo de los telómeros, cambios en la estructura de los telómeros, modificación epigenética, trastornos de proteostasis, disfunción mitocondrial y activación de oncogenes. Las tensiones extrínsecas incluyen señales de daño inflamatorio y/o tisular, radiación o tratamiento químico y privación nutricional 1,2,3,4. Entre los distintos tipos de senescencia, los más comúnmente vistos y bien estudiados son la senescencia replicativa, la senescencia inducida por oncogén (OIS), la senescencia inducida por radiación y la senescencia inducida por terapia (TIS). La OIS es una respuesta celular aguda al daño genotóxico causado por el estrés replicativo generado por la activación aberrante del oncogén y puede, en cierta medida, prevenir la progresión patológica de una lesión preneoplásica a un tumor en toda regla. El TIS ocurre cuando las células tumorales están estresadas por medicamentos quimioterapéuticos o radiación ionizante 5,6.
La senescencia se considera un arma de doble filo en patología debido a su naturaleza altamente dinámica. Inicialmente se describió como un mecanismo supresor de tumores beneficioso para eliminar las células dañadas del grupo circulante de células en división, salvaguardando la función normal de los órganos e inhibiendo el crecimiento tumoral 7,8,9. Sin embargo, la evidencia emergente ha sugerido un lado oscuro de la senescencia. Las células senescentes secretan citoquinas proinflamatorias, conocidas como fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), que conducen a fibrosis y órganos defectuosos y promueven el inicio y la progresión del tumor10. Además, las células cancerosas senescentes se someten a una reprogramación epigenética y de expresión génica en paralelo con la remodelación de la cromatina y la activación de una respuesta sostenida de daño al ADN (DDR)11,12, adquiriendo recientemente nuevas propiedades de células madre cancerosas3. Aunque los tumores con capacidad de senescencia responden mejor a la intervención terapéutica en comparación con los incapaces de senescencia13, la persistencia de las células senescentes puede conducir a un mal pronóstico a largo plazo si no son identificados y eliminados eficazmente por los fármacos senolíticos5. De cualquier manera, un método confiable para evaluar la senescencia es de gran interés clínico, no solo para el pronóstico del tratamiento terapéutico, sino también para el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas a las células senescentes.
Independientemente de los diferentes desencadenantes, las células senescentes exhiben algunas características comunes, incluida la morfología agrandada, aplanada y multinucleada con grandes vacuolas, núcleos significativamente expandidos, formación de heterocromatina asociada a la senescencia rica en H3K9me3 (SAHF) en el núcleo, acumulación persistente de focos del marcador de daño al ADN γH2AX,cip1 p53-p21 activado y RB-p16INK4a mecanismos reguladores del ciclo celular, detención estable del ciclo celular G1, inducción masiva de SASP y actividad elevada asociada a la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal)14. Dado que ningún marcador único es suficiente para definir la senescencia, la tinción enzimática para la actividad SA-β-gal, que se considera el estándar de oro para la detección de senescencia, generalmente se combina con la tinción inmunohistoquímica para H3K9me3 y Ki67 para detectar TIS15. Sin embargo, el SA-β-gal basado en cromosomas químicos es difícil de cuantificar. Aquí, combinamos la detección de SA-β-gal basada en fluorescencia de 5-dodecanoylaminofluoresce-di-β-D-galactopiranosido (C12FDG) basada en fluorescencia (fSA-β-gal) con tinción inmunofluorescente para γH2AX y ADN incorporado a EdU para identificar células senescentes C12FDG + EdU-γH2AX + utilizando el sistema de citómetro de flujo de imágenes avanzadas, que combina la velocidad, la sensibilidad y las imágenes detalladas de una sola célula con información espacial que no se puede proporcionar mediante citometría de flujo y microscopía. Este método permite la generación rápida de imágenes de alta resolución que permiten el posicionamiento y la cuantificación de señales fluorescentes dentro de las células, al tiempo que autoriza el análisis rápido de múltiples muestras mediante la construcción de tuberías estándar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método examinó la capacidad de entrada de senescencia de cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL durante el tratamiento de quimioterapia, con imágenes de campo brillante y cuantificación basada en citometría de flujo. A nivel unicelular, detectamos con éxito poblaciones senescentes C12FDG+EdU-Ki67+ principales en células KARPAS422 y WSU-DLCL2 tratadas, y en menor medida en células OCI-LY1, mientras que la línea celular SU-DHL6 fue resistente al tratamiento. L…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención a Yong Yu de la Universidad Johannes Kepler de Linz (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
Referenzen
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