Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen
Summary
Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.
Abstract
Chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen onherstelbare DNA-schade in kankercellen veroorzaken, wat leidt tot apoptose of vroegtijdige senescentie. In tegenstelling tot apoptotische celdood is senescentie een fundamenteel andere machinerie die de voortplanting van kankercellen beperkt. Tientallen jaren van wetenschappelijke studies hebben de complexe pathologische effecten van senescente kankercellen in tumoren en micro-omgevingen onthuld die kankercellen en stromale cellen moduleren. Nieuw bewijs suggereert dat senescentie een krachtige prognostische factor is tijdens de behandeling van kanker, en daarom is snelle en nauwkeurige detectie van senescente cellen in kankermonsters essentieel. Dit artikel presenteert een methode om therapie-geïnduceerde senescentie (TIS) in kankercellen te visualiseren en te detecteren. Diffuse grote B-cellymfoom (DLBCL) cellijnen werden behandeld met mafosfamide (MAF) of daunorubicine (DN) en onderzocht op de senescentiemarker, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal), de DNA-synthesemarker 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) en de DNA-schademarker gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometer beeldvorming kan helpen bij het genereren van hoge resolutie eencellige beelden in een korte periode van tijd om tegelijkertijd de drie markers in kankercellen te visualiseren en te kwantificeren.
Introduction
Een verscheidenheid aan stimuli kan cellulaire senescentie veroorzaken, waardoor cellen in een staat van stabiele celcyclusstilstand komen. Deze stimuli omvatten intrinsieke signaleringsveranderingen of extrinsieke spanningen. Intrinsieke signalen omvatten progressieve telomeerverkorting, veranderingen in de telomeerstructuur, epigenetische modificatie, proteostasestoornissen, mitochondriale disfunctie en activering van oncogenen. Extrinsieke stress omvat ontstekings- en/of weefselschadesignalen, straling of chemische behandeling en voedingsdeprivatie 1,2,3,4. Onder de verschillende soorten senescentie zijn de meest geziene en goed bestudeerde replicatieve senescentie, oncogen-geïnduceerde senescentie (OIS), door straling geïnduceerde senescentie en therapie-geïnduceerde senescentie (TIS). OIS is een acute cellulaire reactie op genotoxische schade veroorzaakt door replicerende stress gegenereerd door afwijkende oncogene activering en kan tot op zekere hoogte de pathologische progressie van een preneoplastische laesie naar een volledige tumor voorkomen. TIS treedt op wanneer tumorcellen worden belast door chemotherapeutische geneesmiddelen of ioniserende straling 5,6.
Senescentie wordt beschouwd als een tweesnijdend zwaard in de pathologie vanwege de zeer dynamische aard. Het werd aanvankelijk beschreven als een gunstig tumoronderdrukkend mechanisme om beschadigde cellen uit de circulerende pool van delende cellen te verwijderen, de normale functie van organen te beschermen en de tumorgroei te remmen 7,8,9. Opkomend bewijs suggereert echter een donkere kant van senescentie. Senescente cellen scheiden pro-inflammatoire cytokines af, bekend als senescentie-geassocieerd secretoir fenotype (SASP), wat leidt tot fibrose en slecht functionerende organen en tumorinitiatie en progressie bevordert10. Bovendien ondergaan senescente kankercellen epigenetische en genexpressie herprogrammering parallel met chromatineremodellering en activering van een aanhoudende DNA-schaderespons (DDR)11,12, waarbij nieuwe kankerstamceleigenschappen worden verworven3. Hoewel senescentie-capabele tumoren beter reageren op therapeutische interventie in vergelijking met senescentie-incapabeletumoren 13, kan de persistentie van senescente cellen leiden tot een slechte langetermijnprognose als ze niet effectief worden geïdentificeerd en geëlimineerd door senolytische geneesmiddelen5. Hoe dan ook, een betrouwbare methode om senescentie te beoordelen is van aanzienlijk klinisch belang, niet alleen voor de prognose van therapiebehandeling, maar ook voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën gericht op senescente cellen.
Ongeacht verschillende triggers vertonen senescente cellen enkele gemeenschappelijke kenmerken, waaronder vergrote, afgeplatte, multinucleaire morfologie met grote vacuolen, aanzienlijk uitgebreide kernen, vorming van H3K9me3-rijke senescentie-geassocieerde heterochromatine (SAHF) in de kern, aanhoudende accumulatie van DNA-schademarker γH2AX foci, geactiveerd p53-p21CIP1 en Rb-p16INK4a celcyclus regulerende mechanismen, stabiele G1-celcyclusstilstand, massale inductie van SASP en verhoogde senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit14. Aangezien geen enkele marker voldoende is om senescentie te definiëren, wordt enzymatische kleuring voor SA-β-gal-activiteit, die wordt beschouwd als de gouden standaard voor senescentiedetectie, meestal gecombineerd met immunohistochemische kleuring voor H3K9me3 en Ki67 om TIS15 te detecteren. Chemische chromogene sa-β-gal is echter moeilijk te kwantificeren. Hier combineerden we 5-dodecanoylaminofluoresceïne-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) fluorescentie-gebaseerde SA-β-gal (fSA-β-gal) detectie met immunofluorescente kleuring voor γH2AX en EdU-geïncorporeerd DNA om C12FDG + EdU-γH2AX + senescente cellen te identificeren met behulp van het geavanceerde imaging flowcytometersysteem, dat de snelheid, gevoeligheid en gedetailleerde eencellige beelden combineert met ruimtelijke informatie die niet kan worden geleverd door flowcytometrie en microscopie. Deze methode maakt het mogelijk om snel beelden met een hoge resolutie te genereren, waardoor fluorescerende signalen in cellen kunnen worden gepositioneerd en gekwantificeerd, terwijl de snelle analyse van meerdere monsters mogelijk is door standaardpijpleidingen te bouwen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode onderzocht het senescentie-enter vermogen van vier verschillende DLBCL-cellijnen bij chemotherapiebehandeling, met bright-field imaging en flowcytometrie-gebaseerde kwantificering. Op eencellig niveau hebben we met succes belangrijke C12FDG + EdU-Ki67 + senescente populaties gedetecteerd in behandelde KARPAS422- en WSU-DLCL2-cellen, en in mindere mate in OCI-LY1-cellen, terwijl de SU-DHL6-cellijn resistent was tegen de behandeling. Het verschil in senescentie-enter…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een beurs aan Yong Yu van de Johannes Kepler Universiteit Linz (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
Referenzen
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
