הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול
Summary
כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.
Abstract
תרופות כימותרפיות יכולות לגרום לנזק בלתי הפיך לדנ”א בתאים סרטניים, מה שמוביל לאפופטוזיס או לסנסנציה מוקדמת. שלא כמו מוות של תאים אפופטוטיים, סנסנציה היא מנגנון שונה במהותו המרסן את התפשטותם של תאים סרטניים. עשרות שנים של מחקרים מדעיים חשפו את ההשפעות הפתולוגיות המורכבות של תאי סרטן סנסנטיים בגידולים ובמיקרו-סביבה המווסתים תאים סרטניים ותאים סטרומליים. ראיות חדשות מצביעות על כך שסנסנציה היא גורם פרוגנוסטי רב עוצמה במהלך הטיפול בסרטן, ולכן זיהוי מהיר ומדויק של תאים סנסנטיים בדגימות סרטן הוא חיוני. מאמר זה מציג שיטה לדמיין ולזהות סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול (TIS) בתאים סרטניים. קווי תאים מתפזרים של לימפומה של תאי B גדולים (DLBCL) טופלו באמצעות מאפוספמיד (MAF) או דאונורוביצין (DN) ונבדקו לאיתור סמן הסנסנציה, β-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה (SA-β-gal), סמן סינתזת הדנ”א 5-אתניל-2′-דאוקסיורידין (EdU), וסמן הנזק לדנ”א gamma-H2AX (γH2AX). הדמיית ציטומטר זרימה יכולה לסייע ביצירת תמונות חד-תאיות ברזולוציה גבוהה בפרק זמן קצר כדי לדמיין ולכמת בו-זמנית את שלושת הסמנים בתאים סרטניים.
Introduction
מגוון גירויים יכולים לגרום לסנסנציה תאית, ולגרום לתאים להיכנס למצב של עצירה יציבה של מחזור התא. גירויים אלה כוללים שינויי איתות פנימיים או לחצים חיצוניים. אותות פנימיים כוללים קיצור טלומרים פרוגרסיבי, שינויים במבנה הטלומרים, שינוי אפיגנטי, הפרעות פרוטאוסטזיס, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה והפעלה של אונקוגנים. לחצים חיצוניים כוללים אותות דלקת ו/או נזק לרקמות, קרינה או טיפול כימי, וחסך תזונתי 1,2,3,4. מבין הסוגים המובהקים של סנסנציה, הנפוצים ביותר הנראים והנחקרים היטב הם סנסנציה משכפלת, סנסנציה המושרה על ידי אונקוגן (OIS), סנסנציה המושרה על ידי קרינה וסנסנציה המושרה על ידי טיפול (TIS). OIS היא תגובה תאית חריפה לנזק גנוטוקסי הנגרם על ידי עקה משכפלת הנוצרת על ידי הפעלת אונקוגן חריגה ויכולה במידה מסוימת למנוע את ההתקדמות הפתולוגית מנגע קדם-אופלסטי לגידול מלא. TIS קורה כאשר תאי הגידול נלחצים על ידי תרופות כימותרפיות או קרינה מייננת 5,6.
Senescence נחשב חרב פיפיות בפתולוגיה בשל אופיו הדינמי מאוד. הוא תואר בתחילה כמנגנון מדכא גידול מועיל להסרת תאים פגומים ממאגר התאים המתחלקים במחזור הדם, תוך שמירה על תפקודם התקין של האיברים ועיכוב צמיחת הגידול 7,8,9. עם זאת, עדויות חדשות מצביעות על צד אפל של סנסנציה. תאים סנסנטיים מפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים, הידועים בשם פנוטיפ הפרשה הקשור לסנסנציה (SASP), מה שמוביל לפיברוזיס ואיברים לא תקינים ומקדם את התחלת הגידול והתקדמותו10. יתר על כן, תאים סרטניים סנסנטיים עוברים תכנות מחדש אפיגנטי וביטוי גנים במקביל לשיפוץ כרומטין והפעלה של תגובה מתמשכת של נזק לדנ”א (DDR)11,12, תוך רכישת תכונות חדשות של תאי סרטן-גזע3. אף על פי שגידולים בעלי יכולת סנסנסנציה מגיבים טוב יותר להתערבות טיפולית בהשוואה לגידולים שאינם מסוגלים לסנסנציה13, ההתמדה של תאים סנסנטיים עלולה להוביל לפרוגנוזה גרועה לטווח ארוך אם הם לא יזוהו ביעילות ויסולקו על ידי תרופות סנוליטיות5. כך או כך, שיטה אמינה להערכת סנסנציה היא בעלת עניין קליני משמעותי, לא רק לפרוגנוזה של הטיפול, אלא גם לפיתוח אסטרטגיות חדשניות המכוונות לתאים סנסנטיים.
ללא קשר לטריגרים שונים, תאים סנסנטיים מציגים כמה מאפיינים נפוצים, כולל מורפולוגיה מוגדלת, שטוחה ורב-גרעינית עם ואקואולות גדולות, גרעינים מורחבים באופן משמעותי, היווצרות של הטרוכרומטין עשיר בסנסנציה H3K9me3 (SAHF) בגרעין, הצטברות מתמשכת של סמן נזק לדנ”א γH2AX מוקדים, מופעל p53-p21CIP1 ו- Rb-p16INK4a מנגנוני ויסות מחזור התא, עצירת מחזור תאי G1 יציבה, אינדוקציה מסיבית של SASP ופעילות מוגברת הקשורה לסנסנציה β-גלקטוזידאז (SA-β-gal)14. מכיוון שאין מספיק סמן יחיד כדי להגדיר סנסנציה, צביעה אנזימטית עבור פעילות SA-β-gal, הנחשבת לתקן הזהב לזיהוי סנסנציות, משולבת בדרך כלל עם צביעה אימונוהיסטוכימית עבור H3K9me3 ו- Ki67 כדי לזהות TIS15. עם זאת, קשה לכמת SA-β-gal המבוסס על כרומוגניה כימית. כאן, שילבנו 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) מבוסס פלואורסצנציה מבוסס SA-β-gal (fSA-β-gal) עם צביעה אימונופלואורסנטית עבור γH2AX ו- DNA משולב EdU כדי לזהות C12FDG+EdU-γH2AX+ תאים סנסנטיים באמצעות מערכת ציטומטר זרימת ההדמיה המתקדמת, המשלבת את המהירות, הרגישות ותמונות מפורטות של תא יחיד עם מידע מרחבי שלא ניתן לספק על ידי ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה. שיטה זו מאפשרת יצירה מהירה של תמונות ברזולוציה גבוהה המאפשרת מיקום וכימות של אותות פלואורסצנטיים בתוך תאים, תוך מתן רישיון לניתוח מהיר של דגימות מרובות על ידי בניית צינורות סטנדרטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו בחנה את יכולת הכניסה לסנסנציה של ארבעה קווי תאי DLBCL שונים עם טיפול כימותרפי, עם הדמיה בשדה בהיר וכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה. ברמה של תא יחיד, זיהינו בהצלחה אוכלוסיות סנסנטיות עיקריות של C12FDG+EdU-Ki67+ בתאי KARPAS422 ו-WSU-DLCL2 שטופלו, ובמידה פחותה בתאי OCI-LY1, בעוד שקו הת…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ליונג יו מאוניברסיטת יוהנס קפלר לינץ (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
Referenzen
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
