JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

Published: July 29, 2022
doi:
10.3791/64093
, ,
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit,Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

脊椎動物の脳組織に侵入する膠芽腫(GBM)細胞における微小管動態のライブイメージングを可能にする技術を報告する。蛍光タグ付きGBM細胞の透明なゼブラフィッシュ脳への同所性注射と高解像度の生体内イメージングを組み合わせることで、 in situ がん浸潤中の細胞骨格動態の測定が可能になります。

Abstract

実際の集団での生存期間の中央値は6〜15か月で、膠芽腫(GBM)は最も壊滅的な悪性脳腫瘍です。治療の失敗は主にGBM細胞の侵襲性によるものであり、これはGBMの運動特性をよりよく理解する必要性を物語っています。GBMの浸潤を支える分子機構を調べるためには、浸潤時のタンパク質動態の詳細な特性評価を可能にする新しい生理学的モデルが必要です。これらの観察結果は、腫瘍浸潤をブロックし、患者の転帰を改善するための新しい標的の発見への道を開くでしょう。この論文は、ゼブラフィッシュ脳内のGBM細胞の同所性異種移植片が、細胞内の生体内ライブイメージングをどのように可能にするかを報告しています。微小管(MT)に着目し、GBM細胞におけるMT標識、受精後3日(dpf)ゼブラフィッシュ幼虫の透明脳へのGBM細胞のマイクロインジェクション、播種異種移植片におけるMTの生体内イメージング、GBM侵入時のMT動態評価のためのMT動態の変化、および取得したデータの解析の手順について説明します。

Introduction

細胞の運動性は、極性軸の確立と力を生み出す細胞骨格の再配列を必要とする常同型のプロセスです。アクチン重合とそのミオシンとの会合は、細胞の動きに必要な突出力と収縮力の主な寄与因子として認識されています1。微小管は、遊走中の細胞分極と方向性持続性の主なアクターであると考えられています2。近年、MTは、3D3における細胞浸潤中の機械圧縮力をサポートするために突起を作成および安定化することも示されています。最近では、MTは局所接着時のメカノトランスダクションと機械感受性移動に直接関与しています4。MTプラス末端ダイナミクスを特徴付ける動的不安定性は、重合(増殖)と解重合(収縮)の繰り返し相から成り立っており、これらは多数の微小管結合タンパク質と、RHO-GTPase5,6,7によって支配されるような細胞内シグナル伝達カスケードによって制御されています。細胞の移動と浸潤におけるMTネットワークの役割により、MTダイナミクスの研究は、免疫細胞ホーミング、創傷治癒、および癌浸潤のメカニズムをよりよく理解するための重要な要素になりました。

癌細胞が原発腫瘍コアから脱出し、組織内に広がり、二次腫瘍を生成する能力は、50年前に宣言された癌との戦いにおける世界的な成功を防ぐための重要なステップです8,9。最大のハードルの1つは、癌細胞がどのように活発に組織に侵入するかを理解することでした。主要な浸潤メカニズムは、非腫瘍性細胞の移動を支配するものと同じ原理に依存しています10。しかし、がん細胞の遊走特異性が浮上しており11、このタイプの遊走のより良い特徴付けの必要性を引き起こしています。具体的には、腫瘍微小環境ががんの進行のキープレーヤーとして現れるため12、がん細胞の拡散のメカニズムを解明するには、関連する生理学的状況でがん細胞の浸潤を観察および分析することが不可欠です。

MTは、増殖と浸潤の両方を維持するために、癌の進行の中心です。MT動態をその場で正確に分析することで、両方のプロセスでMT変化因子(MTA)を特定することができます。MTのダイナミクスは、環境の変化によって大きく変化します。in vitroでは、ノコダゾールなどのMT不安定化剤による処理は、細胞が3Dでゲルに埋め込まれている場合の細胞突出の形成を防ぎますが、2D細胞の移動にはほとんど影響を与えません13,14。技術的には困難ですが、生体内イメージングの進歩により、がん細胞浸潤中のMT動態のin vivo解析が可能になります。例えば、マウスの皮下異種移植線維肉腫細胞におけるMTの観察は、腫瘍関連マクロファージが腫瘍細胞のMT動態に影響を与えることを明らかにした15。しかし、これらのマウスモデルは広範な外科的処置を必要とし、高浸潤性脳腫瘍であるGBMなどのアクセスしにくい癌には満足のいくものではありません。

15か月の平均生存期間16という悲惨な結果にもかかわらず、脳実質内でのGBMの播種様式や、脳組織へのGBM細胞の浸潤を維持する重要な分子要素についてはほとんど知られていません。マウス同所性異種移植片(PDX)モデルの改善と頭蓋窓の確立は、GBM細胞浸潤研究の新たな展望を提供しました17,18。しかし、イメージング品質が最適ではないため、このモデルは表在性異種移植片の縦断的イメージングをほとんど可能にし、これまでのところ細胞骨格タンパク質の細胞内イメージングの研究に成功していません。さらに、げっ歯類の使用を減らし、低等脊椎動物に置き換えるための「3R」差し止め命令を受けて、代替モデルが確立されました。

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)幼虫で観察された原始免疫を利用して、魚類脳におけるGBM細胞の同所性注射が開発された19,20,21。発達中の中脳における脳室近傍への注射は、ヒトGBM病態生理学21の大部分を要約し、ヒトにおけるのと同じ好ましいGBM浸潤の好ましいパターンが観察される22。魚の幼虫の透明性のおかげで、このモデルは、ほとんどのGBMが発生すると考えられている脳室周囲領域から脳に侵入するGBM細胞の視覚化を可能にします23。

MTはin vitroでのGBM細胞浸潤に不可欠であるため24,25、MTダイナミクスのより良い特性評価と細胞浸潤中の重要な調節因子の同定が必要です。しかし、今日まで、ゼブラフィッシュ同所性モデルで生成されたデータには、侵入過程におけるMT動態の細胞内解析は含まれていない。この論文は、in vivoでのMTダイナミクスを研究し、脳腫瘍浸潤中のその役割を決定するためのプロトコルを提供します。安定した微小管標識に続いて、GBM細胞をゼブラフィッシュ幼虫の脳に3 dpfでマイクロインジェクションし、脳組織での進行中に高い時空間分解能でリアルタイムでイメージングします。蛍光MTのライブイメージングにより、MTプラスエンドダイナミクスの定性的および定量的分析が可能になります。さらに、このモデルにより、MTAがMTダイナミクスおよびGBM細胞の侵襲特性に及ぼす影響をリアルタイムで評価することができます。この比較的非侵襲的なプロトコルは、一度に処理される多数の幼虫と(魚水中での)薬物適用の容易さを組み合わせることで、このモデルを前臨床試験の資産にします。

Protocol

動物実験は、実験動物の取り扱いに関する欧州連合のガイドラインに従って実施されました。すべてのプロトコルは、パスツール研究所の動物実験のための倫理委員会-CEEA 89およびフランスの研究教育省によって承認されました(許可#01265.03)。注射またはライブイメージングセッション中に、動物は実験手順の終了 Tricaine.At 麻酔され、麻酔薬の過剰摂取によって安楽死させた。このプロトコ?…

Representative Results

ここでは、生体内GBM侵潤時にMTが果たす役割を解析するために、レンチウイルス感染によるGBM細胞の安定なMT標識、3 dpfゼブラフィッシュ幼虫におけるGBM細胞の同所性異種移植、MT動態の高解像度生体内イメージング、MTA処理とそのGBM侵潤への影響、MT動態と生体内浸潤の画像解析について説明します(図1)。 MTダイナミクスは、成長および縮小す?…

Discussion

腫瘍異種移植片を単一細胞分解能でイメージングすることは、GBM生物学の理解を深めるために不可欠なツールになる可能性があります。マウスPDXモデルにおけるライブイメージングは、GBMが集合的に脳組織にどのように侵入するかについての貴重な発見をもたらした18。しかし、今日まで、時空間分解能はGBMの侵入を制御するタンパク質のダイナミクスを明らかにするのに?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

P. Herbomel博士(フランス、パスツール研究所)と彼の研究室、特にValérie BriolatとEmma Colucci-Guyonに、ゼブラフィッシュラインとマイクロインジェクションプレート用のプラスチック金型を提供していただき、ゼブラフィッシュの実験手順に関する貴重な専門知識を提供してくださったことに非常に感謝しています。UtechSフォトニックバイオイメージング(C2RT、パスツール研究所、フランス国立研究機関フランスバイオイメージングの支援、およびANR-10-INBS-04;未来への投資)。この研究は、リーグコントレルガン(EL2017。LNCC)、国立科学研究センター、パスツール研究所、そしてマルグリット・ミシェル夫人とポルケ氏の寛大な寄付によって。

Materials

Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The ‘war on cancer’ isn’t yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022)
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , (2000).
  30. E3, M. . Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer’s structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

Microtubule DynamicsGlioblastoma CellsZebrafish BrainSubcellular Intravital ImagingBrain Cancer InvasionProtein AnalysisCell TransplantationMicroinjectionAnesthetized Larvae

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image