Живая визуализация динамики микротрубочек в клетках глиобластомы, вторгающихся в мозг рыбок данио
Summary
Мы сообщаем о методе, позволяющем в реальном времени визуализировать динамику микротрубочек в клетках глиобластомы (GBM), вторгающихся в ткань мозга позвоночных. Соединение ортотопической инъекции флуоресцентно помеченных клеток GBM в прозрачный мозг рыбок данио с прижизненной визуализацией высокого разрешения позволяет измерять динамику цитоскелета во время инвазии рака in situ .
Abstract
С мрачным средним временем выживания в реальных популяциях – от 6 до 15 месяцев – глиобластома (GBM) является наиболее разрушительной злокачественной опухолью головного мозга. Неудача лечения в основном обусловлена инвазивностью клеток GBM, что говорит о необходимости лучшего понимания подвижных свойств GBM. Для исследования молекулярного механизма, поддерживающего инвазию GBM, требуются новые физиологические модели, позволяющие углубленно характеризовать динамику белка во время инвазии. Эти наблюдения проложат путь к открытию новых целей для блокирования инфильтрации опухоли и улучшения результатов лечения пациентов. В этой статье сообщается, как ортотопический ксенотрансплантат клеток GBM в мозге рыбок данио позволяет субклеточную прижизненную живую визуализацию. Сосредоточив внимание на микротрубочках (МТ), мы описываем процедуру маркировки МТ в клетках GBM, микроинъекции клеток GBM в прозрачный мозг через 3 дня после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио, прижизненной визуализации МТ в диссеминирующих ксенотрансплантатах, изменения динамики МТ для оценки их роли во время инвазии GBM и анализа полученных данных.
Introduction
Подвижность клеток является стереотипным процессом, требующим установления оси полярности и силообразующих цитоскелетных перестроек. Полимеризация актина и его связь с миозином признаны основными факторами, способствующими протрузивным и сократительным силам, необходимым для движения клеток1. Микротрубочки считаются основными действующими лицами в поляризации клеток и направленной персистенции во время миграции2. В последние годы было также показано, что МТ создают и стабилизируют протрузии для поддержки механокомпрессивных сил во время инвазии клеток в 3D3. В последнее время МТ принимают непосредственное участие в механотрансдукции при фокальных спайках и механочувствительной миграции4. Динамическая нестабильность, характеризующая конечную динамику МТ-плюс, состоит из повторяющихся фаз полимеризации (роста) и деполимеризации (усадки), которые контролируются множеством микротрубочек-связывающих белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, таких как управляемые RHO-GTPases 5,6,7. Роль сети МТ в миграции и инвазии клеток сделала исследование динамики МТ ключевым элементом для лучшего понимания механизмов самонаведения иммунных клеток, заживления ран и инвазии рака.
Способность раковых клеток покидать первичное ядро опухоли, распространяться в тканях и генерировать вторичные опухоли является критическим шагом в предотвращении глобального успеха в войне против рака, объявленной 50 лет назад 8,9. Одним из самых больших препятствий было понимание того, как раковые клетки активно вторгаются в ткани. Ключевые механизмы инвазии основаны на тех же принципах, что и те, которые управляют миграцией неопухолевых клеток10. Тем не менее, особенности миграции раковых клеток выявили11, что вызвало необходимость лучшей характеристики этого типа миграции. В частности, поскольку микроокружение опухоли выступает в качестве ключевого игрока в прогрессировании рака12, наблюдение и анализ инвазии раковых клеток в соответствующем физиологическом контексте имеет важное значение для разгадки механизмов распространения раковых клеток.
МТ играют центральную роль в прогрессировании рака, чтобы поддерживать как пролиферацию, так и инвазию. Точный анализ динамики МТ in situ может помочь идентифицировать МТ-изменяющие агенты (МТА) в обоих процессах. Динамика MT резко меняется в зависимости от изменения окружающей среды. In vitro лечение МТ-дестабилизирующими агентами, такими как нокодазол, предотвращает образование протрузии клеток, когда клетки встроены в гели в 3D, тогда как оно мало влияет на миграцию 2D клеток13,14. Несмотря на технические сложности, достижения в области прижизненной визуализации позволяют in vivo анализировать динамику МТ во время инвазии раковых клеток. Например, наблюдение МТ в подкожно ксенотрансплантированных клетках фибросаркомы у мышей показало, что опухолеассоциированные макрофаги влияют на динамику МТ в опухолевых клетках15. Тем не менее, эти мышиные модели включают обширные хирургические процедуры и остаются неудовлетворительными для менее доступных видов рака, таких как высокоинвазивная опухоль головного мозга, GBM.
Несмотря на мрачное 15-месячное среднее время выживания16, мало что известно о способе распространения GBM в паренхиме мозга или ключевых молекулярных элементах, поддерживающих инвазию клеток GBM в ткани мозга. Улучшение модели ортотопического ксенотрансплантата мышей (PDX) и создание черепных окон открыли новые перспективы для исследований инвазии клеток GBM17,18. Однако из-за неоптимального качества визуализации эта модель в основном позволяла продольную визуализацию поверхностных ксенотрансплантатов и до сих пор не была успешно использована для изучения субклеточной визуализации белков цитоскелетов. Кроме того, после введения запрета “3R” на сокращение использования грызунов и замену их низшими позвоночными были созданы альтернативные модели.
Используя преимущества примитивного иммунитета, наблюдаемого у личинок рыбок данио (Danio rerio), ортотопическая инъекция клеток GBM в мозг рыбы была разработана 19,20,21. Инъекция в непосредственной близости от желудочков в развивающемся среднем мозге рекапитулирует большую часть патофизиологии GBM человека21, и наблюдается та же предпочтительная картина инвазии GBM, что и у человека – ко-вариант сосудов –22. Благодаря прозрачности личинок рыб эта модель позволяет визуализировать клетки GBM, вторгающиеся в мозг из перижелудочковых областей, где, как полагают, возникает большинство GBM23.
Поскольку МТ необходимы для инвазии клеток GBM in vitro 24,25, необходима лучшая характеристика динамики МТ и идентификация ключевых регуляторов во время клеточной инвазии. Однако на сегодняшний день данные, полученные с помощью ортотопической модели рыбок данио, не включали субклеточный анализ динамики МТ в процессе инвазии. В данной работе представлен протокол для изучения динамики МТ in vivo и определения ее роли при инвазии рака мозга. После стабильной маркировки микротрубочек клетки GBM микроинъецируются с 3 dpf в мозг личинок рыбок данио и визуализируются в режиме реального времени с высоким пространственно-временным разрешением во время их прогрессирования в ткани мозга. Живая визуализация флуоресцентных МТ позволяет проводить качественный и количественный анализ динамики МТ плюс-энд. Кроме того, эта модель позволяет оценить влияние MTA на динамику MT и на инвазивные свойства клеток GBM в режиме реального времени. Этот относительно неинвазивный протокол в сочетании с большим количеством личинок, обрабатываемых одновременно, и простотой применения препарата (в рыбьей воде) делает модель активом для доклинических испытаний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуализация опухолевых ксенотрансплантатов с одноклеточным разрешением, вероятно, станет незаменимым инструментом для улучшения нашего понимания биологии GBM. Живая визуализация в мышиных моделях PDX привела к ценным открытиям о том, как GBM коллективно вторгается в ткань мозга<sup class="xre…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы чрезвычайно благодарны доктору. Хербомелю (Институт Пастера, Франция) и его лаборатории, особенно Валери Бриола и Эмме Колуччи-Гийон за предоставление нам линий для рыбок данио и пластиковой формы для микроинъекционных пластин, а также за их ценный опыт в экспериментальных процедурах рыбок данио. Мы с благодарностью выражаем признательность UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, при поддержке Французского национального исследовательского агентства France BioImaging, и ANR-10-INBS-04; Инвестиции в будущее). Эта работа была поддержана Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Национальный центр научных исследований и Институт Пастера, а также благодаря щедрым пожертвованиям г-жи Маргариты МИШЕЛЬ и г-на Порке.
Materials
| Glioblastoma cell culture | |||
| Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
| Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
| Lenitivirus production | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
| Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
| Zebrafish husbandry | |||
| Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
| Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
| Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
| Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
| Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
| Xenotransplantation | |||
| 24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
| Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
| CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
| Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
| Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
| Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
| Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
| Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
| Intravital Imaging | |||
| 3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
| Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
| Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
| Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
Referenzen
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
- Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
- Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
- Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
- Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
- Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
- Nature editorial. The ‘war on cancer’ isn’t yet won. Nature. 601 (297), (2022).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
- Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
- Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
- Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
- Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
- Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
- Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
- Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Volvic source water mineral composition. Volvic Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022)
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , (2000).
- E3, M. . Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , (2011).
- Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
- Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
- Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
- Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
- Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
- Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
- Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer’s structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
- Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
- Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
- Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
- Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
- Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
- Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
- Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
- Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).
