Imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invadindo o cérebro do peixe-zebra

Summary

Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .

Abstract

Com um tempo de sobrevida mediano sombrio em populações reais – entre 6 a 15 meses – o glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais devastador. A falha do tratamento deve-se principalmente à invasividade das células GBM, o que fala da necessidade de uma melhor compreensão das propriedades móveis do GBM. Para investigar o mecanismo molecular que suporta a invasão de GBM, são necessários novos modelos fisiológicos que permitam uma caracterização aprofundada da dinâmica das proteínas durante a invasão. Essas observações abririam o caminho para a descoberta de novos alvos para bloquear a infiltração tumoral e melhorar os resultados dos pacientes. Este artigo relata como um xenoenxerto ortotópico de células GBM no cérebro do peixe-zebra permite imagens intravitais subcelulares vivas. Com foco em microtúbulos (MTs), descrevemos um procedimento para marcação de MT em células GBM, microinjeção de células GBM no cérebro transparente de larvas de peixe-zebra 3 dias após a fertilização (dpf), imagem intravital de MTs nos xenoenxertos disseminadores, alteração da dinâmica de MT para avaliar seu papel durante a invasão de GBM e análise dos dados adquiridos.

Introduction

A motilidade celular é um processo estereotipado que requer o estabelecimento do eixo polaridade e rearranjos citoesqueléticos geradores de força. A polimerização da actina e sua associação com a miosina são reconhecidas como os principais contribuintes para as forças protrusivas e contráteis necessárias para o movimento celular¹. Os microtúbulos são considerados os principais atores na polarização celular e na persistência direcional durante a migração². Nos últimos anos, os MTs também demonstraram criar e estabilizar saliências para suportar forças mecanocompressivas durante a invasão celular em 3D³. Mais recentemente, os MTs têm estado diretamente envolvidos na mecanotransdução em aderências focais e migração mecanossensível⁴. A instabilidade dinâmica que caracteriza a dinâmica final MT-plus é composta por repetidas fases de polimerização (crescimento) e despolimerização (encolhimento), que são controladas por uma infinidade de proteínas ligadoras de microtúbulos e cascatas de sinalização intracelular, como as regidas por RHO-GTPases ^5,6,7. O papel da rede de MT na migração e invasão celular tornou a investigação da dinâmica da MT um elemento-chave para entender melhor os mecanismos de homing de células imunes, cicatrização de feridas e invasão de câncer.

A capacidade das células cancerígenas de escapar do núcleo primário do tumor, se espalhar nos tecidos e gerar tumores secundários é um passo crítico na prevenção do sucesso global na guerra contra o câncer declarada há 50 anos ^8,9. Um dos maiores obstáculos tem sido entender como as células cancerosas invadem ativamente o tecido. Os principais mecanismos de invasão baseiam-se nos mesmos princípios que regem a migração de células não tumorais¹⁰. No entanto, surgiram especificidades da migração de células cancerígenas¹¹, desencadeando a necessidade de melhor caracterização desse tipo de migração. Especificamente, como o microambiente tumoral aparece como peça-chave na progressão do câncer¹², observar e analisar a invasão de células cancerígenas em um contexto fisiológico relevante é essencial para desvendar os mecanismos de disseminação de células cancerígenas.

As MTs são fundamentais para a progressão do câncer, para sustentar tanto a proliferação quanto a invasão. A análise precisa da dinâmica da MT in situ pode ajudar a identificar os agentes de alteração da MT (MTA) em ambos os processos. A dinâmica da MT varia drasticamente após uma mudança no ambiente. In vitro, o tratamento com agentes desestabilizadores de MT, como o nocodazol, previne a formação de protrusão celular quando as células são incorporadas em géis em 3D, ao passo que tem pouco efeito sobre a migração celular 2D^13,14. Embora tecnicamente desafiadores, os avanços na imagem intravital permitem a análise in vivo da dinâmica da MT durante a invasão de células cancerígenas. Por exemplo, a observação de MTs em células de fibrossarcoma xenoenxertado por via subcutânea em camundongos revelou que macrófagos associados a tumores afetam a dinâmica da MT em células tumorais¹⁵. No entanto, esses modelos de camundongos envolvem extensos procedimentos cirúrgicos e permanecem insatisfatórios para cânceres menos acessíveis, como o tumor cerebral altamente invasivo, GBM.

Apesar de um tempo médio de sobrevivência sombrio de^{15 meses 16}, pouco se sabe sobre o modo de disseminação do GBM dentro do parênquima cerebral ou os principais elementos moleculares que sustentam a invasão celular do GBM no tecido cerebral. A melhora no modelo de xenoenxerto ortotópico (PDX) de camundongos e o estabelecimento de janelas cranianas ofereceram novas perspectivas para estudos de invasão celular de GBM^17,18. No entanto, devido à qualidade de imagem abaixo do ideal, este modelo tem permitido principalmente imagens longitudinais de xenoenxertos superficiais e não tem sido usado com sucesso para estudar imagens subcelulares de proteínas do citoesqueleto até o momento. Além disso, na sequência da injunção “3Rs” para reduzir a utilização de roedores e substituí-los por vertebrados inferiores, foram estabelecidos modelos alternativos.

Aproveitando a imunidade primitiva observada em larvas de peixe-zebra (Danio rerio), desenvolveu-se a injeção ortotópica de células GBM no cérebro do peixe 19,20,21. A injeção nas proximidades dos ventrículos do mesencéfalo em desenvolvimento recapitula a maior parte da fisiopatologia do GBM humano²¹, e o mesmo padrão preferido de invasão do GBM que nos humanos – cooptação de vasos – é observado²². Graças à transparência das larvas de peixes, este modelo permite a visualização de células GBM que invadem o cérebro a partir das áreas peri-ventriculares onde se pensa que a maioria dos GBMs surge²³.

Como as MTs são essenciais para a invasão celular de GBM in vitro^24,25, é necessária uma melhor caracterização da dinâmica da MT e a identificação dos principais reguladores durante a invasão celular. No entanto, até o momento, os dados gerados com o modelo ortotópico do peixe-zebra não incluíram a análise subcelular da dinâmica da MT durante o processo de invasão. Este artigo fornece um protocolo para estudar a dinâmica da MT in vivo e determinar seu papel durante a invasão do câncer cerebral. Após a marcação estável dos microtúbulos, as células GBM são microinjetadas a 3 dpf no cérebro das larvas de peixe-zebra e fotografadas em tempo real em alta resolução espaço-temporal durante sua progressão no tecido cerebral. A imagem ao vivo de MTs fluorescentes permite a análise qualitativa e quantitativa da dinâmica MT plus-end. Além disso, este modelo permite avaliar o efeito dos MTAs na dinâmica da MT e nas propriedades invasivas das células GBM em tempo real. Este protocolo relativamente não invasivo combinado com um grande número de larvas manuseadas de cada vez e a facilidade de aplicação de drogas (na água de peixe) torna o modelo um trunfo para testes pré-clínicos.

Protocol

As experiências com animais foram conduzidas de acordo com as orientações da União Europeia para o manuseamento de animais de laboratório. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Institut Pasteur – CEEA 89 e pelo Ministério da Pesquisa e Educação da França (alvará nº 01265.03). Durante as injeções ou sessões de imagem ao vivo, os animais foram anestesiados com Tricaine.At final dos procedimentos experimentais, foram eutanasiados por overdose anestésica. Cons…

Representative Results

Para analisar o papel desempenhado pelos MTs durante a invasão in vivo do GBM, descrevemos aqui os principais passos para realizar a marcação estável do MT em células GBM por infecção lentiviral, xenotransplante ortotópico de células GBM em larvas de peixe-zebra 3 dpf, imagens intravitais de alta resolução da dinâmica MT, tratamento MTA e seus efeitos na invasão GBM e análise de imagens da dinâmica MT e invasão in vivo (Figura 1). A dinâm…

Discussion

A imagem de xenoenxertos tumorais em resolução unicelular provavelmente se tornará uma ferramenta indispensável para melhorar nossa compreensão da biologia do GBM. Imagens ao vivo em modelos PDX de camundongos levaram a descobertas valiosas sobre como o GBM invade coletivamente o tecido cerebral¹⁸. No entanto, até o momento, a resolução espaço-temporal não é alta o suficiente para revelar a dinâmica das proteínas que controlam a invasão de GBM. Raciocinamos que, ao acoplar o enxerto …

Materials

Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum	Eurobio	CVFSVF00-01	Reagent
MEM NEAA	Gibco	11140-050	Reagent
Modified Eagle's medium	Eurobio	CM1MEM18-01	Reagent
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-122	Reagent
U-87 MG	ECACC	89081402-1VL	Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III	BD bioscience		Instrument
BD FACSDiva software v8.0	BD bioscience		Software
HEK-293T	Merck	12022001	Cells
pMD2.G	Addgene	Plasmid #12259	Reagent
psPAX2	Addgene	Plasmid #12260	Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80	Beckman Coulter		Instrument
Cell passaging and staining
dPBS	Gibco	14190-094	Chemical
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054	Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC	LEICA	https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/	Instrument
Methylene Blue hydrate	Sigma-Aldrich	M4159	Chemical
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-25G	Chemical
Transfer Pipettes fine tips	Samco Scientific	232	Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL	Samco Scientific	225	Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	Cat#: A5040	Chemical
Volvic Source Water	DUTSCHER DOMINIQUE SAS	999556	Reagent
Xenotransplantation
24-well plate	TPP	92024	Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)	Harvard Apparatus	(#30-0017 GC100-15	Equipment
CellTram oil vario microinjector	Eppendorf	5176000.025	Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL	Eppendorf	5242956003	Equipment
Micromanipulator	NARISHIGE	https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html	Equipment
Mineral Oil	Sigma	M8410-100ml	Equipment
Stereomicroscope	Olympus	KL 2500 LCD	Instrument
Universal capillary holder	Eppendorf	5176190002	Equipment
Vertical Pipette puller	KOPF (Roucaire)	Model 720	Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish	MatTek Life Sciences, MA, USA	P35G-1,5-14-C	Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21	Nikon		Software
Heat-Block	Techne	DRI-BLOCK DB-2D	Equipment
Microscope head Nikon Ti2E	Nikon		Instrument
sCMOS camera Prime 95B	Photometrics		Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4	Hammatsu		Instrument
Ultrapure Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit	Hammatsu		Instrument
Drug Treatment
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Chemical
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404-2MG	Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software	Oxford Instruments		Software
ImarisFileConverter 9.5.1	Oxford Instruments		Software