Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .
Com um tempo de sobrevida mediano sombrio em populações reais – entre 6 a 15 meses – o glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais devastador. A falha do tratamento deve-se principalmente à invasividade das células GBM, o que fala da necessidade de uma melhor compreensão das propriedades móveis do GBM. Para investigar o mecanismo molecular que suporta a invasão de GBM, são necessários novos modelos fisiológicos que permitam uma caracterização aprofundada da dinâmica das proteínas durante a invasão. Essas observações abririam o caminho para a descoberta de novos alvos para bloquear a infiltração tumoral e melhorar os resultados dos pacientes. Este artigo relata como um xenoenxerto ortotópico de células GBM no cérebro do peixe-zebra permite imagens intravitais subcelulares vivas. Com foco em microtúbulos (MTs), descrevemos um procedimento para marcação de MT em células GBM, microinjeção de células GBM no cérebro transparente de larvas de peixe-zebra 3 dias após a fertilização (dpf), imagem intravital de MTs nos xenoenxertos disseminadores, alteração da dinâmica de MT para avaliar seu papel durante a invasão de GBM e análise dos dados adquiridos.
A motilidade celular é um processo estereotipado que requer o estabelecimento do eixo polaridade e rearranjos citoesqueléticos geradores de força. A polimerização da actina e sua associação com a miosina são reconhecidas como os principais contribuintes para as forças protrusivas e contráteis necessárias para o movimento celular1. Os microtúbulos são considerados os principais atores na polarização celular e na persistência direcional durante a migração2. Nos últimos anos, os MTs também demonstraram criar e estabilizar saliências para suportar forças mecanocompressivas durante a invasão celular em 3D3. Mais recentemente, os MTs têm estado diretamente envolvidos na mecanotransdução em aderências focais e migração mecanossensível4. A instabilidade dinâmica que caracteriza a dinâmica final MT-plus é composta por repetidas fases de polimerização (crescimento) e despolimerização (encolhimento), que são controladas por uma infinidade de proteínas ligadoras de microtúbulos e cascatas de sinalização intracelular, como as regidas por RHO-GTPases 5,6,7. O papel da rede de MT na migração e invasão celular tornou a investigação da dinâmica da MT um elemento-chave para entender melhor os mecanismos de homing de células imunes, cicatrização de feridas e invasão de câncer.
A capacidade das células cancerígenas de escapar do núcleo primário do tumor, se espalhar nos tecidos e gerar tumores secundários é um passo crítico na prevenção do sucesso global na guerra contra o câncer declarada há 50 anos 8,9. Um dos maiores obstáculos tem sido entender como as células cancerosas invadem ativamente o tecido. Os principais mecanismos de invasão baseiam-se nos mesmos princípios que regem a migração de células não tumorais10. No entanto, surgiram especificidades da migração de células cancerígenas11, desencadeando a necessidade de melhor caracterização desse tipo de migração. Especificamente, como o microambiente tumoral aparece como peça-chave na progressão do câncer12, observar e analisar a invasão de células cancerígenas em um contexto fisiológico relevante é essencial para desvendar os mecanismos de disseminação de células cancerígenas.
As MTs são fundamentais para a progressão do câncer, para sustentar tanto a proliferação quanto a invasão. A análise precisa da dinâmica da MT in situ pode ajudar a identificar os agentes de alteração da MT (MTA) em ambos os processos. A dinâmica da MT varia drasticamente após uma mudança no ambiente. In vitro, o tratamento com agentes desestabilizadores de MT, como o nocodazol, previne a formação de protrusão celular quando as células são incorporadas em géis em 3D, ao passo que tem pouco efeito sobre a migração celular 2D13,14. Embora tecnicamente desafiadores, os avanços na imagem intravital permitem a análise in vivo da dinâmica da MT durante a invasão de células cancerígenas. Por exemplo, a observação de MTs em células de fibrossarcoma xenoenxertado por via subcutânea em camundongos revelou que macrófagos associados a tumores afetam a dinâmica da MT em células tumorais15. No entanto, esses modelos de camundongos envolvem extensos procedimentos cirúrgicos e permanecem insatisfatórios para cânceres menos acessíveis, como o tumor cerebral altamente invasivo, GBM.
Apesar de um tempo médio de sobrevivência sombrio de15 meses 16, pouco se sabe sobre o modo de disseminação do GBM dentro do parênquima cerebral ou os principais elementos moleculares que sustentam a invasão celular do GBM no tecido cerebral. A melhora no modelo de xenoenxerto ortotópico (PDX) de camundongos e o estabelecimento de janelas cranianas ofereceram novas perspectivas para estudos de invasão celular de GBM17,18. No entanto, devido à qualidade de imagem abaixo do ideal, este modelo tem permitido principalmente imagens longitudinais de xenoenxertos superficiais e não tem sido usado com sucesso para estudar imagens subcelulares de proteínas do citoesqueleto até o momento. Além disso, na sequência da injunção “3Rs” para reduzir a utilização de roedores e substituí-los por vertebrados inferiores, foram estabelecidos modelos alternativos.
Aproveitando a imunidade primitiva observada em larvas de peixe-zebra (Danio rerio), desenvolveu-se a injeção ortotópica de células GBM no cérebro do peixe 19,20,21. A injeção nas proximidades dos ventrículos do mesencéfalo em desenvolvimento recapitula a maior parte da fisiopatologia do GBM humano21, e o mesmo padrão preferido de invasão do GBM que nos humanos – cooptação de vasos – é observado22. Graças à transparência das larvas de peixes, este modelo permite a visualização de células GBM que invadem o cérebro a partir das áreas peri-ventriculares onde se pensa que a maioria dos GBMs surge23.
Como as MTs são essenciais para a invasão celular de GBM in vitro24,25, é necessária uma melhor caracterização da dinâmica da MT e a identificação dos principais reguladores durante a invasão celular. No entanto, até o momento, os dados gerados com o modelo ortotópico do peixe-zebra não incluíram a análise subcelular da dinâmica da MT durante o processo de invasão. Este artigo fornece um protocolo para estudar a dinâmica da MT in vivo e determinar seu papel durante a invasão do câncer cerebral. Após a marcação estável dos microtúbulos, as células GBM são microinjetadas a 3 dpf no cérebro das larvas de peixe-zebra e fotografadas em tempo real em alta resolução espaço-temporal durante sua progressão no tecido cerebral. A imagem ao vivo de MTs fluorescentes permite a análise qualitativa e quantitativa da dinâmica MT plus-end. Além disso, este modelo permite avaliar o efeito dos MTAs na dinâmica da MT e nas propriedades invasivas das células GBM em tempo real. Este protocolo relativamente não invasivo combinado com um grande número de larvas manuseadas de cada vez e a facilidade de aplicação de drogas (na água de peixe) torna o modelo um trunfo para testes pré-clínicos.
A imagem de xenoenxertos tumorais em resolução unicelular provavelmente se tornará uma ferramenta indispensável para melhorar nossa compreensão da biologia do GBM. Imagens ao vivo em modelos PDX de camundongos levaram a descobertas valiosas sobre como o GBM invade coletivamente o tecido cerebral18. No entanto, até o momento, a resolução espaço-temporal não é alta o suficiente para revelar a dinâmica das proteínas que controlam a invasão de GBM. Raciocinamos que, ao acoplar o enxerto …
The authors have nothing to disclose.
Estamos extremamente gratos ao Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, França) e seu laboratório, especialmente Valérie Briolat e Emma Colucci-Guyon por nos fornecerem as linhas de peixe-zebra e o molde plástico para placas de microinjeção, e por sua valiosa experiência em procedimentos experimentais de peixe-zebra. Agradecemos a UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, apoiada pela Agência Nacional de Pesquisa da França BioImaging, e ANR-10-INBS-04; Investimentos para o Futuro). Este trabalho foi apoiado pela Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), o Centre National de la Recherche Scientifique, e o Institut Pasteur e pelas generosas doações da Sra. Marguerite MICHEL e do Sr. Porquet.
Glioblastoma cell culture | |||
Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
Lenitivirus production | |||
BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
Cell passaging and staining | |||
dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
Zebrafish husbandry | |||
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
Xenotransplantation | |||
24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
Intravital Imaging | |||
3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
Drug Treatment | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
Image Analysis | |||
Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |