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Biologie

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

Published: July 29, 2022
doi:
10.3791/64093
, ,
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit,Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

우리는 척추 동물의 뇌 조직을 침범하는 교 모세포종 (GBM) 세포에서 미세 소관 역학의 실시간 이미징을 허용하는 기술을보고합니다. 형광 태그가 부착된 GBM 세포를 투명한 제브라피쉬 뇌에 동종 주입하는 것을 고해상도 생체 내 이미징과 결합하면 현장 암 침범 중에 세포 골격 역학을 측정할 수 있습니다.

Abstract

실제 인구에서 6개월에서 15개월 사이의 암울한 생존 기간을 가진 교모세포종(GBM)은 가장 치명적인 악성 뇌종양입니다. 치료 실패는 주로 GBM 세포의 침습성으로 인한 것이며, 이는 GBM 운동성 특성에 대한 더 나은 이해의 필요성을 말해줍니다. GBM 침입을 지원하는 분자 메커니즘을 조사하려면 침입 중 단백질 역학의 심층적 인 특성화를 가능하게하는 새로운 생리 학적 모델이 필요합니다. 이러한 관찰은 종양 침윤을 차단하고 환자 결과를 개선하기 위한 새로운 표적의 발견으로 가는 길을 열어줄 것입니다. 이 논문은 제브라 피쉬 뇌에서 GBM 세포의 동종 이종 이식이 어떻게 세포 내 생체 내 생체 내 이미징을 허용하는지보고합니다. 미세소관(MTs)에 초점을 맞추어 GBM 세포에서 MT 표지, 수정 후 3일(dpf) 제브라피쉬 유충의 투명한 뇌에 GBM 세포를 미세 주입하는 절차, 전파하는 이종 이식편에서 MT의 생체 내 이미징, GBM 침입 동안 역할을 평가하기 위한 MT 역학 변경 및 획득한 데이터 분석 절차를 설명합니다.

Introduction

세포 운동성은 극성 축 설정 및 힘 생성 세포 골격 재 배열을 요구하는 고정 관념의 과정입니다. 액틴 중합 및 미오신과의 연관성은 세포 이동에 필요한 돌출 및 수축력의 주요 원인으로 인식됩니다1. 미세소관은 이동 중 세포 분극 및 방향 지속성의 주요 행위자로 간주됩니다2. 최근 몇 년 동안 MT는 3D3에서 세포 침습 중에 기계 압축력을 지원하기 위해 돌출부를 생성하고 안정화하는 것으로 나타났습니다. 보다 최근에, MT는 초점 유착 및 기계 민감성 이동에서 기계 변환에 직접 관여했습니다4. MT-plus 말단 역학을 특징짓는 동적 불안정성은 중합(성장) 및 해중합(수축)의 반복적인 단계로 이루어지며, 이는 과다한 미세소관 결합 단백질 및 RHO-GTPases 5,6,7에 의해 제어되는 것과 같은 세포 내 신호 전달 캐스케이드에 의해 제어됩니다. 세포 이동 및 침습에서 MT 네트워크의 역할로 인해 MT 역학 조사는 면역 세포 유도, 상처 치유 및 암 침습의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위한 핵심 요소가 되었습니다.

암세포가 원발성 종양 코어를 탈출하여 조직에 퍼지고 이차 종양을 생성하는 능력은 50년 전에 선언된 암과의 전쟁에서 세계적인 성공을 막는 데 중요한 단계입니다 8,9. 가장 큰 장애물 중 하나는 암세포가 어떻게 적극적으로 조직을 침범하는지 이해하는 것입니다. 주요 침습 메커니즘은 비종양성 세포 이동을 지배하는 것과 동일한 원리에 의존합니다10. 그러나 암세포 이동 특이성이나타났고11, 이러한 유형의 이동에 대한 더 나은 특성화의 필요성을 촉발했습니다. 특히, 종양 미세 환경이 암 진행의 핵심 플레이어로 나타나기 때문에12, 관련 생리학적 맥락에서 암세포 침습을 관찰하고 분석하는 것은 암세포 전파 메커니즘을 밝히는 데 필수적입니다.

MT는 증식과 침습을 모두 유지하기 위해 암 진행의 핵심입니다. 현장 MT 역학의 정확한 분석은 두 공정 모두에서 MT 변경 에이전트(MTA)를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. MT 역학은 환경 변화에 따라 크게 달라집니다. 시험관 내에서 노코다졸과 같은 MT 불안정화제로 처리하면 세포가 3D 겔에 매립될 때 세포 돌출 형성을 방지하는 반면 2D 세포 이동에는 거의 영향을 미치지 않습니다13,14. 기술적으로 어렵지만 생체 내 이미징의 발전으로 암세포 침범 중 MT 역학의 생체 내 분석이 가능합니다. 예를 들어, 마우스의 피하 이종 이식 섬유육종 세포에서 MT를 관찰한 결과, 종양-관련 대식세포가 종양 세포(15)에서 MT 역학에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이러한 마우스 모델은 광범위한 수술 절차를 포함하며 고도로 침습성 뇌종양 인 GBM과 같이 접근하기 어려운 암에 대해서는 만족스럽지 않습니다.

15개월의 평균 생존 기간16이라는 암울한 기간에도 불구하고, GBM이 뇌 실질 내에서 전파되는 방식이나 뇌 조직에서 GBM 세포 침습을 유지하는 핵심 분자 요소에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 마우스 동종 이종 이식 (PDX) 모델의 개선과 두개골 창의 확립은 GBM 세포 침습 연구17,18에 대한 새로운 전망을 제공했습니다. 그러나 최적이 아닌 이미징 품질로 인해이 모델은 대부분 표면 이종 이식편의 종 방향 이미징을 허용했으며 지금까지 세포 골격 단백질의 세포 내 이미징을 연구하는 데 성공적으로 사용되지 않았습니다. 또한 설치류의 사용을 줄이고 더 낮은 척추 동물로 대체하라는 “3R”명령에 따라 대체 모델이 확립되었습니다.

제브라피쉬(Danio rerio) 유충에서 관찰된 원시면역을 이용하여, 어류 뇌에 GBM 세포의 동교토픽 주사가 19,20,21 개발되었다. 발달 중뇌에서 심실 부근으로의 주입은 대부분의 인간 GBM 병리생리학(21)을 요약하고, 인간에서와 동일한 바람직한 GBM 침습 패턴-혈관 공동-옵션이 관찰된다(22). 물고기 유충의 투명성 덕분에이 모델은 대부분의 GBM이 발생하는 것으로 생각되는 뇌실 주위 영역에서 뇌를 침범하는 GBM 세포의 시각화를 허용합니다23.

MT는 시험관 내 GBM 세포 침습24,25에 필수적이기 때문에 MT 역학의 더 나은 특성 분석과 세포 침윤 중 주요 조절자의 식별이 필요합니다. 그러나 현재까지 제브라 피쉬 동종 모델로 생성 된 데이터에는 침입 과정 동안 MT 역학의 세포 내 분석이 포함되지 않았습니다. 이 논문은 생체 내에서 MT 역학을 연구하고 뇌암 침범 동안 그 역할을 결정하는 프로토콜을 제공합니다. 안정적인 미세소관 표지에 따라 GBM 세포는 제브라피쉬 유충의 뇌에 3dpf로 미세 주입되고 뇌 조직에서 진행되는 동안 높은 시공간 해상도로 실시간으로 이미징됩니다. 형광 MT의 라이브 이미징을 통해 MT 플러스 엔드 역학의 정성 및 정량 분석이 가능합니다. 또한 이 모델을 통해 MTA가 MT 역학 및 GBM 세포의 침습적 특성에 미치는 영향을 실시간으로 평가할 수 있습니다. 한 번에 처리되는 많은 수의 유충과 결합 된이 비교적 비 침습적 인 프로토콜과 약물 적용의 용이성 (어류에서)은이 모델을 전임상 테스트의 자산으로 만듭니다.

Protocol

동물 실험은 실험실 동물의 취급에 대한 유럽 연합 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 프로토콜은 파스퇴르 연구소 동물 실험 윤리위원회 – CEEA 89와 프랑스 연구 교육부 (허가 # 01265.03)의 승인을 받았습니다. 주사 또는 라이브 이미징 세션 동안, 동물은 실험 절차가 끝날 Tricaine.At 마취되었고, 마취 과다 복용에 의해 안락사되었다. 이 프로토콜에 사용되는 재료, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세?…

Representative Results

생체 내 GBM 침습 동안 MT가 수행하는 역할을 분석하기 위해 렌티바이러스 감염에 의한 GBM 세포에서 안정적인 MT 표지를 수행하는 주요 단계, 3개의 dpf 제브라피쉬 유충에서 GBM 세포의 동종 이종 이식, MT 역학의 고해상도 생체 내 이미징, MTA 치료 및 GBM 침습에 미치는 영향, MT 역학 및 생체 내 침습의 이미지 분석(그림 1)을 설명합니다. MT 역학은 성장 ?…

Discussion

단일 세포 분해능에서 종양 이종 이식편을 이미징하는 것은 GBM 생물학에 대한 이해를 향상시키는 데 없어서는 안될 도구가 될 것입니다. 마우스 PDX 모델에서의 라이브 이미징은 GBM이 어떻게 집합적으로 뇌 조직을 침범하는지에 대한 귀중한 발견으로 이어졌습니다(18). 그러나 현재까지 시공간 해상도는 GBM 침입을 제어하는 단백질의 역학을 밝힐만큼 충분히 높지 않습니다. 우리?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 P. Herbomel 박사 (프랑스 파스퇴르 연구소)와 그의 실험실, 특히 Valérie Briolat과 Emma Colucci-Guion에게 제브라 피쉬 라인과 미세 주입 플레이트 용 플라스틱 몰드를 제공하고 제브라 피쉬 실험 절차에 대한 귀중한 전문 지식을 제공해 주셔서 대단히 감사합니다. 우리는 UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, 프랑스 국립 연구 기관 France BioImaging의 지원을 받음) 및 ANR-10-INBS-04; 미래를위한 투자). 이 작업은 리그 콘트레 르 암(EL2017. LNCC), 국립 과학 센터, 파스퇴르 연구소, 그리고 Marguerite MICHEL 부인과 Porquet 씨의 관대 한 기부금으로.

Materials

Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software
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Referenzen

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The ‘war on cancer’ isn’t yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022)
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , (2000).
  30. E3, M. . Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer’s structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

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Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).
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