Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos
Summary
Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.
Abstract
La inmunoterapia basada en anticuerpos monoclonales dirigida a los antígenos tumorales es ahora un pilar del tratamiento del cáncer. Uno de los mecanismos de acción clínicamente relevantes de los anticuerpos es la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), en la que el anticuerpo se une a las células cancerosas y activa el componente celular del sistema inmunitario, por ejemplo, las células asesinas naturales (NK), para destruir las células tumorales. La eficacia de estas terapias podría mejorarse mediante la identificación de compuestos adyuvantes que aumenten la sensibilidad de las células cancerosas o la potencia de las células inmunitarias. Además, las interacciones farmacológicas no descubiertas en pacientes de cáncer comedicados por afecciones previas o síntomas asociados con el cáncer pueden determinar el éxito de la terapia con anticuerpos; por lo tanto, es necesario eliminar estas interacciones farmacológicas no deseadas. Con estos objetivos en mente, creamos un modelo de ADCC para el cáncer y describimos aquí un protocolo simple para encontrar fármacos moduladores de ADCC. Dado que los modelos 3D, como los esferoides de células cancerosas, son superiores a los cultivos 2D en la predicción de las respuestas in vivo de los tumores a las terapias contra el cáncer, los cocultivos esferoides de células de cáncer de mama HER2+ JIMT-1 que expresan EGFP y el NK92. Se establecieron líneas celulares CD16 y se indujeron con trastuzumab, un anticuerpo monoclonal clínicamente aprobado contra el cáncer de mama HER2 positivo. Se permitió que los esferoides JIMT-1 se formaran en placas de 96 pocillos con fondo en U repelentes a las células. El día 3 se añadieron células NK y trastuzumab. A continuación, los esferoides se tiñeron con anexina V-Alexa 647 para medir la muerte celular apoptótica, que se cuantificó en la zona periférica de los esferoides con un microscopio automatizado. La aplicabilidad de nuestro ensayo para identificar moléculas moduladoras de ADCC se demuestra al mostrar que Sunitinib, un inhibidor del receptor tirosina quinasa aprobado por la FDA contra el cáncer metastásico, elimina casi por completo el ADCC. La generación de esferoides y las canalizaciones de adquisición y análisis de imágenes son compatibles con el cribado de alto rendimiento de compuestos moduladores de ADCC en esferoides de células cancerosas.
Introduction
Los esferoides tumorales multicelulares (MCTS) son modelos tridimensionales (3D) ampliamente utilizados que se forman debido a la tendencia de las células adherentes a agregarse y representan una herramienta importante para obtener información mecanicista sobre la biología de las células cancerosas. Pueden generarse a partir de una amplia gama de tipos celulares mediante numerosas técnicas, como los cultivos 3D basados en líquidos y en andamios1. Su principal ventaja sobre los modelos 2D monocapa es que recapitulan las principales características de los tumores in vivo , a saber, la organización estructural y la hipoxia, imitando el comportamiento biológico de las células tumorales, especialmente los mecanismos que conducen al escape terapéutico y la resistencia a los fármacos2. Por lo tanto, dado que los MCTS pueden mejorar la previsibilidad de la toxicidad y la sensibilidad a los medicamentos, se utilizan ampliamente para estudiar cánceres en 3D y podrían mejorar el desarrollo de medicamentos efectivos para diferentes tipos de cáncer3.
Para estudiar cualquier enfermedad, existe una necesidad crítica de modelos relevantes y convenientes. La creación de modelos para estudios de inmunología del cáncer es un reto porque el sistema inmunitario está formado por varios tipos de células. Cada tipo de célula tiene varios subtipos y un amplio espectro de estados de activación. Estos diferentes tipos de células inmunitarias interactúan con las células cancerosas y otros componentes tumorales, lo que en última instancia influye en el resultado de la enfermedad. Los métodos de cultivo celular in vitro 2D no logran recapitular estas complejas interacciones celulares, ya que carecen de traducibilidad y son incapaces de predecir la acción de un fármaco a nivel de sistema (por ejemplo, en tejidos)4,5. Además, los modelos de ratón también tienen graves limitaciones debido a las diferencias fundamentales entre el sistema inmunitario humano y el murino. Los sistemas de cultivo 3D pueden, por lo tanto, llenar los vacíos actuales en los modelos disponibles, proporcionando un método alternativo y mejorando nuestra comprensión de la inmunología del cáncer6. En concreto, los modelos de esferoides podrían utilizarse para probar inmunoterapias, principalmente para evaluar la eficacia del cribado de fármacos y los anticuerpos terapéuticos para mejorar la infiltración de células inmunitarias y los efectos antitumorales contra las dianas esferoides7. Además, se ha demostrado ampliamente el potencial de los MCTS compuestos por células en diferentes estados metabólicos y proliferativos para estudiar las interacciones entre las células del estroma (por ejemplo, linfocitos, macrófagos, fibroblastos) y las células cancerosas y para el desarrollo de nuevas estrategias contra el cáncer8. Por lo tanto, existe una necesidad vital de corroborar plataformas predictivas y precisas para impulsar el proceso de prueba de fármacos, teniendo en cuenta la fisiopatología del microambiente tumoral.
El cáncer de mama (CM) es el cáncer más frecuente diagnosticado en mujeres a nivel mundial. La clasificación clínica de esta enfermedad heterogénea se basa en la presencia de receptores transmembrana, por ejemplo, receptores de estrógeno (RE) y progesterona (PR) (denominados colectivamente receptores hormonales, HR) junto con la sobreexpresión o amplificación de la proteína/oncogén del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Con base en la expresión inmunohistoquímica de estos receptores, se reconocen comúnmente cuatro subtipos: cáncer de mama luminal A (HR+/HER2-), luminal B (HR+/HER2+), HER2-positivo (HR-/HER2+) y triple negativo (HR-/HER2-). El grupo HER2+ constituye el 10-15% de los casos de CM y se caracteriza por una alta expresión de HER2 con ausencia de RE y PR, con peor pronóstico en comparación con los tumores luminales y requiriendo fármacos específicos dirigidos contra la proteína HER2/neu9.
El desarrollo del CM es un proceso de varios pasos, y un diagnóstico precoz es esencial para un tratamiento exitoso de la enfermedad10. Sin embargo, a pesar de las opciones de tratamiento personalizadas de la CM que han surgido recientemente (p. ej., terapias endocrinas y de anticuerpos anti-HER2), la CM sigue siendo un reto para los oncólogos. Al igual que la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, estas terapias personalizadas también pueden tener efectos adversos graves y los pacientes pueden desarrollar resistencia a estos agentes, lo que hace que sea un desafío a largo plazo determinar la mejor estrategia11,12. Por lo tanto, una mejor comprensión de la interacción entre el tumor y su microambiente es esencial y se espera que proporcione nuevas direcciones para el desarrollo de nuevos tratamientos que tengan en cuenta las especificidades de los diferentes subtipos de CM13. Se está estudiando una nueva ola de inmunoterapias, como los conjugados anticuerpo-fármaco, las terapias adoptivas de células T, las vacunas y los nuevos anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a HER2 en una amplia población de pacientes con tumores que expresan HER214.
El trastuzumab, por ejemplo, representa una modalidad de tratamiento eficaz para el CM HER2+. Como parte de su modo de acción, el trastuzumab media las actividades dependientes del receptor gamma cristalizable de fragmentos (FcγR). Los FcγR se distinguen por su afinidad por el fragmento Fc y la respuesta inmunitaria que inician. La activación de FcγRIIIa (CD16A) en las células asesinas naturales (NK) es crucial para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), mientras que la activación de FcγRIIa (CD32A) y FcγRIIIa en macrófagos induce fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP)15. Los estudios en modelos animales mostraron que los ratones que carecían de receptores FcγRI (CD64) y FcγRIII (CD16) no pudieron iniciar respuestas inmunitarias protectoras contra antígenos específicos del tumor, lo que revela que ADCC es probablemente un mecanismo de acción importante para el mAb Trastuzumab16.
Dado que las células NK recurren a los Abs unidos a las células tumorales para la destrucción de las células cancerosas por ADCC, la expresión de los receptores Fc es fundamental para un tratamiento eficaz con Trastuzumab17 (Figura 1). Además, su acción se equilibra eficientemente mediante la estimulación de los receptores activadores e inhibidores, por ejemplo, los receptores similares a las inmunoglobulinas de las células asesinas (KIR)18.
Figura 1. Mecanismo de ADCC en el contexto de una respuesta antitumoral. El receptor Fcγ de una célula asesina natural (NK) reconoce la región Fc de un anticuerpo, que previamente se había unido a un antígeno de superficie en una célula cancerosa. Esta sinapsis inmunológica conduce a la degranulación de la célula NK, que libera mediadores citotóxicos como las granzimas y la perforina. Estas moléculas contribuyen a la formación de poros en la membrana celular y activan las vías apoptóticas provocando la muerte celular programada de la célula diana (imagen creada con Biorender.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El desarrollo de inmunoterapia para HER2+ BC representa un campo en evolución. En este caso, se deben considerar las interacciones entre varios componentes del sistema inmunológico. Además, publicaciones anteriores han probado ampliamente terapias combinadas que involucran todo tipo de terapias tradicionales, inmunes o celulares para identificar combinaciones sinérgicas19.
Varios modelos 3D de HER2+ BC se han utilizado previamente para el descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, Balalaeva et al. utilizaron esferoides SKBR-3 que sobreexpresan HER2 para evaluar la citotoxicidad de la inmunotoxina 4D5scFv-PE40 dirigida a HER220. En otro estudio, se estableció un sistema de cultivo de HER2+ BC basado en 3D Matrigel, para medir el crecimiento celular en respuesta a Trastuzumab y agentes endocrinos21. Estos estudios ponen de manifiesto la importancia de los modelos de esferoides tumorales de células cancerosas con sobreexpresión de HER2 para representar una estrategia eficaz para mejorar clínicamente las respuestas terapéuticas22.
Nuestro grupo identificó previamente Sunitinib, un inhibidor de la tirosina quinasa multidirigido, como un inhibidor de ADCC dependiente de Trastuzumab en células JIMT-1 HER2+ BC en un ensayo de cultivo 2D. El estudio reveló que Sunitinib induce la autofagia y perjudica la función de destrucción de las células NK, regulando a la baja la expresión de HER2 y mejorando la adhesión a la superficie de las células JIMT-117.
Aquí establecimos un nuevo modelo ADCC esferoide en 3D (células cancerosas NK.92.CD16 + Trastuzumab + JIMT-1-EGFP) que se utilizará para aplicaciones de cribado de alto rendimiento y, con el fin de validar los hallazgos mencionados anteriormente, se utilizó Sunitinib como compuesto modelo. En primer lugar, generamos células EGFP que expresan JIMT-117 y cultivamos esferoides a partir de estas células. La ADCC fue inducida por células NK junto con Trastuzumab, y los esferoides se mantuvieron en cultivo en presencia o ausencia de compuestos de prueba durante 24 h (Figura 2). La cuantificación de ADCC se basa en la detección de la muerte de células cancerosas apoptóticas (tinción de anexina V) mediante un sistema de análisis de alto contenido.
Figura 2. ADCC en un sistema de cocultivo de esferoides 3D. Nuestros entornos experimentales se basan en un sistema de esferoides 3D que puede modelar con mayor precisión el microentorno in vivo en comparación con los modelos 2D. Las células de cáncer de mama JIMT-1 EGFP se sembraron en un fondo cóncavo repelente de células para formar un grupo celular de forma redonda, llamado esferoide. A continuación, se inició ADCC añadiendo NK92. Células asesinas naturales CD16 (relación E:T = 20:1) y un anticuerpo monoclonal anti-HER2, Trastuzumab. El modelo experimental ha demostrado ser eficiente y fácilmente aplicable para la identificación de compuestos de prueba modificadores de ADCC (imagen creada con Biorender.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Demostramos que la adquisición de datos de esta manera se puede hacer en tiempo real y es estadísticamente robusta para su uso en el cribado de alto contenido en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer. Es importante destacar que este modelo permite una validación extendida de un conjunto más grande de compuestos y se puede aplicar a varios ensayos de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de las mejoras significativas en el tratamiento de la CM en las últimas décadas, los pacientes todavía desarrollan regularmente resistencia a la medicación o experimentan efectos secundarios negativos24. La alta morbilidad y mortalidad ligada a la CM exige una investigación continua de los mecanismos moleculares subyacentes, así como plataformas de cribado robustas para identificar nuevas moléculas procesables para el desarrollo terapéutico25. Estas estrateg…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LV recibió financiación de las subvenciones de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS”, GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 y K147482. Este proyecto ha recibido financiación de la Red Húngara de Investigación HUN-REN. Las células CD16.176V.NK-92 se obtuvieron del Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Filadelfia, PA, en nombre de Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), están protegidos por patentes en todo el mundo y fueron licenciados por Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Los autores agradecen a György Vereb y Árpád Szöőr su ayuda con el uso de la línea celular NK-92 y el TR-F(ab’)2, y por el asesoramiento técnico.
Materials
| 96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC 6055302 | for spheroids measurements |
| 96-well tissue culture plates | TPP | 92096 | for cell seeding |
| α-MEM medium | Sigma | M8042 | in NK medium |
| Agarose | Sigma | A9539 | for spheroids seeding |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | for apoptosis measurement with HCS |
| CD16.176 V.NK-92 cells | Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | for cell culture |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | for staining of NK cells |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | for statistical analysis | |
| Harmony software | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | for HCA | |
| IL-2 | Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary | PHC0026 | in NK medium |
| Insulin (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 breast cancer cells | for cell culture | ||
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | for HCA |
| PBS (Posphate buffered saline) | Lonza | BE17-517Q | for washing the cells |
| Penicillin-Streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. József T zsér, University of Debrecen) |
for JIMT-1-EGFP cell line | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | for treatments |
| Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary | NDC-63459-303-43 | for treatments |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször |
Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen | for treatments |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Biosera | LM-T1706 | for cells detachment |
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