揭示髓母细胞瘤的铁死亡表型

Summary

脂质氢过氧化物含量是最常用的铁死亡指标。本文演示了铁死亡诱导后细胞中脂质氢过氧化物含量的分步流式细胞术分析。

Abstract

铁和氧的相互作用是地球上生命发展不可或缺的一部分。尽管如此，这种独特的化学反应仍然令人着迷和困惑，导致了新的生物冒险。2012 年，哥伦比亚大学的一个研究小组认识到这种相互作用是导致一种名为“铁死亡”的新型受调节细胞死亡的核心事件。铁死亡的主要特征是由于 （1） 抗氧化防御功能失调和/或 （2） 压倒性的氧化应激而导致的脂质氢过氧化物积累，这通常与细胞中游离不稳定铁含量的增加相吻合。这通常由胱氨酸转运蛋白 xCT、谷胱甘肽 （GSH） 和 GSH 过氧化物酶 4 （GPx4） 组成的经典抗铁死亡轴来防止。由于铁死亡不是一种程序性类型的细胞死亡，因此它不涉及细胞凋亡特征的信号通路。证明此类细胞死亡的最常见方法是使用亲脂性抗氧化剂（维生素 E、ferrostatin-1 等）来预防它。这些分子可以接近质膜中的氧化损伤并解毒。揭示铁死亡表型的另一个重要方面是检测脂质氢过氧化物的先前积累，为此使用特异性染料 BODIPY C11。本手稿将展示如何使用不同的诱导剂在野生型髓母细胞瘤细胞中诱导铁死亡：erastin、RSL3 和铁供体。同样，将使用在 NAC 存在下生长并在去除 NAC 后发生铁死亡的 xCT-KO 细胞。特征性的“冒泡”表型在铁死亡触发后的 12-16 小时内在光学显微镜下可见。此外，将使用 BODIPY C11 染色后进行 FACS 分析，以使用 PI 染色法显示脂质氢过氧化物的积累和随之而来的细胞死亡。为了证明细胞死亡的铁死亡性质，ferrostatin-1 将用作特异性铁死亡预防剂。

Introduction

铁死亡是一种新环境化的活性氧 （ROS） 依赖性细胞死亡类型¹。除了 ROS，铁在这种类型的细胞死亡中起着至关重要的作用，因此得名²。铁死亡的最后也是执行步骤是铁催化脂质氧化损伤在质膜中的积累，最终导致细胞完整性和选择性通透性受损，最后导致细胞因冒泡而死亡。脂质加氢过氧化事件是一种自然发生的现象;然而，细胞的抗氧化防御阻止了它在整个细胞膜中的传播。在这种情况下，主要参与者是 Se 蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4 （GPx4），它可以接近膜并将脂质氢过氧化物转化为毒性较小的醇衍生物³。GPx4 的还原能力主要但不限于谷胱甘肽 （GSH） 提供，谷胱甘肽 （GSH） 是一种由非必需氨基酸（甘氨酸、谷氨酸和半氨酸）组成的三肽。GSH 生物合成的限速氨基酸是半胱氨酸⁴。虽然半胱氨酸被归类为非必需氨基酸，但它的需求很容易超过其在高度增殖细胞（如癌细胞）中的内部产生。因此，它被重新归类为半必需氨基酸组。半胱氨酸的必要输入主要通过 Xc- 系统进行，它允许以牺牲谷氨酸输出为代价输入氧化（显性）形式的半胱氨酸（又名胱氨酸）⁵。Xc- 系统由一个 Na+ 非依赖性、Cl 依赖性转运亚基（称为 xCT）和一个伴侣亚基（称为 CD98）组成。直到最近，xCT-GSH-GPx4 轴的抗铁死亡特性一直被视为独特且不可复制的⁶。然而，在 2019 年，已经描述了一种由泛醇（辅酶 Q10）及其再生酶 – 铁死亡抑制蛋白 1 （FSP1） 组成的替代抗铁死亡途径 ^7,8。不久之后，又报道了另一种涉及 GTP 环水解酶-1/四氢生物蝶呤 （GCH1/BH4） 的脂质氢过氧化物解毒系统⁹。尽管如此，xCT-GSH-GPx4 轴在预防铁死亡中的核心作用似乎没有受到挑战。

在过去的十年中，铁死亡已在多种肿瘤类型中得到广泛研究，显示出作为抗癌策略的巨大潜力（由 Lei 等人综述¹⁰）。此外，据报道，对常规化疗药物表现出高度耐药性和/或转移倾向的癌细胞对铁死亡诱导剂（例如 GPx4 抑制剂）非常敏感 11,12,13。然而，在脑肿瘤的情况下，铁死亡诱导剂的潜力在很大程度上仍未得到充分研究。虽然这种类型的细胞死亡与脑缺血再灌注损伤¹⁴和神经退行性疾病¹⁵ 密切相关，但它在脑肿瘤中的潜力主要局限于胶质母细胞瘤，这是最常见的恶性颅脑肿瘤（由 Zhuo 等人综述 ¹⁶）。另一方面，髓母细胞瘤（最常见的恶性儿科脑肿瘤和儿童死亡的主要原因）对铁死亡诱导剂的敏感性在很大程度上仍未得到探索。据我们所知，很少有同行评审的文献将铁死亡和髓母细胞瘤联系起来。尽管如此，一些研究表明，铁在髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤癌症干细胞 （CSC） 的存活、增殖和致瘤潜力中起着至关重要的作用^17,18，可能使它们更容易受到铁死亡诱导的影响。这一点尤其重要，因为髓母细胞瘤因其 CSC 或肿瘤起始/增殖细胞亚群而臭名昭著，这似乎是导致肿瘤化疗耐药、播散和复发的主要原因¹⁹。

通常通过测量脂质氢过氧化物含量/积累来研究对铁死亡诱导的敏感性，这可能导致也可能不会导致细胞死亡。最常用的铁死亡诱导剂是 （1） erastin，xCT 转运蛋白²⁰ 的抑制剂，（2） RSL3，GPx4 酶² 的抑制剂，和/或 （3） 铁供体，如柠檬酸铁铵 （FAC）²¹。使用选择性探针 BODIPY 581/591 C11²² 评估脂质氢过氧化物含量，其在还原态下在 581/591 nm 处具有最大激发和发射波长。在与脂质氢过氧化物相互作用并被脂质氢过氧化物氧化时，探针将其激发和发射最大值移至 488/510 nm。通常，脂质氢过氧化物含量的显著增加在铁死亡细胞死亡之前。由于铁死亡不是程序性细胞死亡，因此没有分子信号级联导致其执行。因此，确认它的唯一方法是监测脂质氢过氧化物含量并使用针对此类细胞死亡的特异性抑制剂，例如铁司他汀 1²³。Ferrostatin 1 是一种亲脂性抗氧化剂，可以穿透细胞的脂质区室并解毒脂质氢过氧化物，从而防止铁死亡事件。

Protocol

本研究使用 DAOY 野生型 （WT） 髓母细胞瘤细胞系进行，这些细胞系在 37 °C 和 5% CO2 中在补充有 8% FBS 的 DMEM 培养基中培养。在相同条件下维持 xCT 缺失的细胞系，在补充有 1 mM N-乙酰半胱氨酸 （NAC） 的培养基中进行实验。使用市售的支原体检测试剂盒（参见 材料表）定期筛选细胞的支原体，并培养至第 10 代。 1. 收获和接种细胞 <p …

Representative Results

将髓母细胞瘤细胞系 DAOY 在补充有 8% FBS 的标准 DMEM 培养基中培养，直至达到约 60% 汇合。根据 表 1，在实验当天，收获细胞，每孔 1,00,000 个细胞接种在 6 孔板中。第二天，用 1 μM erastin、0.3 μM RSL3 或 250 μM FAC 处理细胞（一式三份）。然后将板置于 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。6 小时后，在显微镜下观察细胞以检测冒泡细胞，如图 1 中的箭头所示。这作为…

Discussion

铁死亡细胞死亡的主要标志是脂质氢过氧化物在质膜中不受控制的积累。这种氧化损伤可能以酶或非酶的方式发生，但在任何一种情况下，反应都是铁依赖性/催化的，这解释了这种细胞死亡的名称。脂质加氢过氧化通常通过测量脂质加氢过氧化的降解产物（如 4-羟基-2,3-反式壬烯醛 （4-HNE） 或丙二醛 （MDA））来间接估计。这些产物由多不饱和脂肪酸的过氧化分解产生，可与各种大分子反应，导?…

Materials

BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin – EDTA 10X – 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100