Entschlüsselung des ferroptotischen Phänotyps des Medulloblastoms
Summary
Der Gehalt an Lipidhydroperoxid ist der am häufigsten verwendete Indikator für den feroptotischen Zelltod. Dieser Artikel zeigt die Schritt-für-Schritt-Durchflusszytometrie-Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in Zellen nach Ferroptose-Induktion.
Abstract
Die Wechselwirkung von Eisen und Sauerstoff ist ein integraler Bestandteil der Entwicklung des Lebens auf der Erde. Nichtsdestotrotz fasziniert und rätselt diese einzigartige Chemie immer wieder und führt zu neuen biologischen Unternehmungen. Im Jahr 2012 erkannte eine Gruppe der Columbia University diese Wechselwirkung als zentrales Ereignis, das zu einer neuen Art des regulierten Zelltods namens “Ferroptose” führt. Das Hauptmerkmal der Ferroptose ist die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden aufgrund von (1) dysfunktionaler antioxidativer Abwehr und/oder (2) überwältigendem oxidativem Stress, der am häufigsten mit einem erhöhten Gehalt an freiem labilem Eisen in der Zelle zusammenfällt. Dies wird normalerweise durch die kanonische antiferroptotische Achse verhindert, die aus dem Cystintransporter xCT, Glutathion (GSH) und GSH-Peroxidase 4 (GPx4) besteht. Da es sich bei der Ferroptose nicht um eine programmierte Art des Zelltods handelt, sind keine für die Apoptose charakteristischen Signalwege beteiligt. Der gebräuchlichste Weg, diese Art des Zelltods nachzuweisen, ist die Verwendung von lipophilen Antioxidantien (Vitamin E, Ferrostatin-1 usw.), um ihn zu verhindern. Diese Moleküle können sich oxidativen Schäden in der Plasmamembran nähern und diese entgiften. Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Aufklärung des ferroptotischen Phänotyps ist der Nachweis der vorangegangenen Akkumulation von Lipidhydroperoxiden, für die der spezifische Farbstoff BODIPY C11 verwendet wird. Das vorliegende Manuskript wird zeigen, wie Ferroptose in Wildtyp-Medulloblastomzellen mit Hilfe verschiedener Induktoren induziert werden kann: Erastin, RSL3 und Eisendonor. In ähnlicher Weise werden die xCT-KO-Zellen verwendet, die in Gegenwart von NAC wachsen und nach der Entfernung von NAC einer Ferroptose unterzogen werden. Der charakteristische “bubble” Phänotyp ist unter dem Lichtmikroskop innerhalb von 12-16 Stunden ab dem Zeitpunkt der Auslösung der Ferroptose sichtbar. Darüber hinaus wird eine BODIPY C11-Färbung mit anschließender FACS-Analyse verwendet, um die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden und den daraus resultierenden Zelltod mit der PI-Färbemethode zu zeigen. Um die ferroptotische Natur des Zelltods nachzuweisen, wird Ferrostatin-1 als spezifisches Ferroptose-verhinderndes Mittel verwendet.
Introduction
Ferroptose ist eine neu kontextualisierte, von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) abhängige Art des Zelltods1. Neben ROS spielt Eisen eine entscheidende Rolle(n) bei dieser Art des Zelltods, daher der Name2. Der letzte und ausführende Schritt der Ferroptose ist die eisenkatalysierte Akkumulation oxidativer Schäden an Lipiden in der Plasmamembran, die schließlich zu einer Beeinträchtigung der Membranintegrität und selektiven Permeabilität und schließlich zum Zelltod durch Blasenbildung führt. Das Lipid-Hydroperoxidationsereignis ist ein natürlich vorkommendes Phänomen. Seine Ausbreitung in der Zellmembran wird jedoch durch die antioxidative Abwehr der Zelle verhindert. Der Hauptakteur in diesem Zusammenhang ist die Se-Protein-Glutathionperoxidase 4 (GPx4), die sich der Membran nähern und Lipidhydroperoxide in ihre weniger toxischen Alkoholderivateumwandeln kann 3. Die reduzierende Kraft für GPx4 wird hauptsächlich, aber nicht ausschließlich, durch Glutathion (GSH) bereitgestellt, ein Tripeptid, das aus den nicht-essentiellen Aminosäuren Glycin, Glutamat und Cystein besteht. Die geschwindigkeitsbestimmende Aminosäure für die Biosynthese von GSH ist Cystein4. Obwohl Cystein als nicht-essentielle Aminosäure eingestuft wird, kann sein Bedarf seine interne Produktion in stark proliferativen Zellen (wie Krebszellen) leicht übersteigen. Damit wurde es wieder in die Gruppe der semi-essentiellen Aminosäuren eingeordnet. Der notwendige Import von Cystein erfolgt hauptsächlich durch das Xc-System, das den Import der oxidierten (dominanten) Form von Cystein (aka Cystin) auf Kosten des Glutamatexportsermöglicht 5. Das Xc-System setzt sich aus einer Na+-unabhängigen, Cl-abhängigen Transportuntereinheit, bekannt als xCT, und einer Chaperon-Untereinheit, bekannt als CD98, zusammen. Bis vor kurzem galten die antiferroptotischen Eigenschaften der xCT-GSH-GPx4-Achse als einzigartig und unreproduzierbar6. Im Jahr 2019 wurde jedoch ein alternativer antiferroptotischer Signalweg, bestehend aus Ubiquinol (Coenzym Q10) und seinem regenerativen Enzym – dem Ferroptose-Suppressorprotein 1 (FSP1) – beschrieben 7,8. Bald darauf wurde über ein weiteres Lipidhydroperoxid-Entgiftungssystem mit GTP-Cyclohydrolase-1/Tetrahydrobiopterin (GCH1/BH4) berichtet9. Nichtsdestotrotz scheint die zentrale Rolle der xCT-GSH-GPx4-Achse bei der Prävention der Ferroptose nicht in Frage gestellt zu werden.
In den letzten zehn Jahren wurde die Ferroptose bei einer Vielzahl von Tumorarten ausgiebig untersucht, was ein großes Potenzial als Anti-Krebs-Strategie zeigt (überprüft von Lei et al.10). Darüber hinaus wurde berichtet, dass Krebszellen, die eine hohe Resistenz gegen konventionelle Chemotherapeutika und/oder eine Neigung zur Metastasierung aufweisen, überraschend empfindlich auf Ferroptose-Induktoren, wie z. B. Inhibitoren von GPx4 11,12,13, reagieren. Im Zusammenhang mit Hirntumoren ist das Potenzial ferroptotischer Induktoren jedoch noch weitgehend wenig untersucht. Während diese Art des Zelltods eng mit zerebralen Ischämie-Reperfusionsschäden14und neurodegenerativen Erkrankungen15 in Verbindung gebracht wurde, beschränkte sich ihr Potenzial im Zusammenhang mit Hirntumoren hauptsächlich auf das Glioblastom, den häufigsten bösartigen Schädel-Hirn-Tumor (überprüft von Zhuo et al.16). Auf der anderen Seite ist die Empfindlichkeit des Medulloblastoms, dem häufigsten bösartigen Hirntumor bei Kindern und einer der Hauptursachen für die Kindersterblichkeit, gegenüber Ferroptose-Induktoren weitgehend unerforscht. Nach unserem Kenntnisstand gibt es kaum begutachtete Literatur, die Ferroptose und Medulloblastom in Verbindung bringt. Nichtsdestotrotz haben einige Studien gezeigt, dass Eisen eine entscheidende Rolle für das Überleben, die Proliferation und das tumorigene Potenzial sowohl von Medulloblastom- als auch von Glioblastom-Krebsstammzellen (CSCs) spielt17,18 und sie möglicherweise anfälliger für Ferroptose-Induktion macht. Dies ist von besonderer Bedeutung, da das Medulloblastom berüchtigt ist für seine Subpopulation von CSCs oder tumorinitiierenden/-vermehrenden Zellen, die weitgehend für die Chemoresistenz, Dissemination und den Rückfall von Tumoren verantwortlich zu sein scheinen19.
Die Empfindlichkeit gegenüber der Ferroptose-Induktion wird in der Regel durch Messung des Gehalts/der Akkumulation von Lipidhydroperoxiden untersucht, die zum Zelltod führen können oder auch nicht. Die am häufigsten verwendeten Ferroptose-Induktoren sind (1) Erastin, ein Inhibitor des xCT-Transporters20, (2) RSL3, ein Inhibitor des GPx4-Enzyms2, und/oder (3) Eisendonoren, wie z. B. Ferroammoniumcitrat (FAC)21. Der Gehalt an Lipidhydroperoxid wird mit der selektiven Sonde BODIPY 581/591 C1122 bestimmt, die im reduzierten Zustand Anregungs- und Emissionsmaxima bei 581/591 nm aufweist. Bei Wechselwirkung mit und Oxidation durch Lipidhydroperoxide verschiebt die Sonde ihre Anregungs- und Emissionsmaxima auf 488/510 nm. Typischerweise geht ein signifikanter Anstieg des Lipidhydroperoxidgehalts dem feroptotischen Zelltod voraus. Da es sich bei der Ferroptose nicht um einen programmierten Zelltod handelt, gibt es keine molekulare Signalkaskade, die zu ihrer Ausführung führt. Daher besteht die einzige Möglichkeit, dies zu bestätigen, darin, den Gehalt an Lipidhydroperoxid zu überwachen und spezifische Inhibitoren für diese Art des Zelltods zu verwenden, wie z. B. Ferrostatin 123. Ferrostatin 1 ist ein lipophiles Antioxidans, das in das Lipidkompartiment der Zelle eindringen und Lipidhydroperoxide entgiften kann, wodurch ferroptotische Ereignisse verhindert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das primäre Kennzeichen des ferroptotischen Zelltods ist die unkontrollierte Akkumulation von Lipidhydroperoxiden in der Plasmamembran. Diese oxidative Schädigung kann auf enzymatische oder nicht-enzymatische Weise auftreten, aber in beiden Fällen ist die Reaktion eisenabhängig/katalysiert, was den Namen dieser Art des Zelltods erklärt. Die Lipidhydroperoxidation wird oft indirekt durch Messung der Abbauprodukte der Lipidhydroperoxidation geschätzt, wie z. B. 4-Hydroxy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) oder Malonaldehyd (M…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Regierung des Fürstentums Monaco sowie von der “Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer” (GEMLUC) und der Flavien-Stiftung unterstützt, die die Mittel für den Kauf von BD FACS Melody zur Verfügung stellte.
Materials
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
Referenzen
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