Medulloblastomun Ferroptotik Fenotipinin Ortaya Çıkarılması
Summary
Lipid hidroperoksit içeriği, ferroptotik hücre ölümünün en yaygın kullanılan göstergesini temsil eder. Bu makale, ferroptoz indüksiyonu üzerine hücrelerdeki lipid hidroperoksit içeriğinin adım adım akış sitometrisi analizini göstermektedir.
Abstract
Demir ve oksijenin etkileşimi, Dünya’daki yaşamın gelişiminin ayrılmaz bir parçasıdır. Bununla birlikte, bu eşsiz kimya büyülemeye ve şaşırtmaya devam ederek yeni biyolojik girişimlere yol açıyor. 2012 yılında, bir Columbia Üniversitesi grubu, bu etkileşimi “ferroptoz” adı verilen yeni bir tür düzenlenmiş hücre ölümüne yol açan merkezi bir olay olarak kabul etti. Ferroptozun en önemli özelliği, (1) işlevsiz antioksidan savunma ve/veya (2) hücrede serbest kararsız demir içeriğinin artmasıyla çakışan ezici oksidatif strese bağlı lipid hidroperoksitlerin birikmesidir. Bu normalde sistin taşıyıcı xCT, glutatyon (GSH) ve GSH peroksidaz 4’ü (GPx4) içeren kanonik anti-ferroptotik eksen tarafından önlenir. Ferroptoz, programlanmış bir hücre ölümü türü olmadığından, apoptozun karakteristik sinyal yollarını içermez. Bu tip hücre ölümünü kanıtlamanın en yaygın yolu, bunu önlemek için lipofilik antioksidanlar (E vitamini, ferrostatin-1 vb.) kullanmaktır. Bu moleküller plazma zarındaki oksidatif hasara yaklaşabilir ve detoksifiye edebilir. Ferroptotik fenotipin ortaya çıkarılmasında bir diğer önemli husus, spesifik BODIPY C11 boyasının kullanıldığı önceki lipid hidroperoksit birikimini tespit etmektir. Bu el yazması, vahşi tip medulloblastom hücrelerinde farklı indükleyiciler kullanılarak ferroptozun nasıl indüklenebileceğini gösterecektir: erastin, RSL3 ve demir verici. Benzer şekilde, NAC varlığında büyüyen ve NAC çıkarıldıktan sonra ferroptoza uğrayan xCT-KO hücreleri kullanılacaktır. Karakteristik “köpüren” fenotip, ferroptozun tetiklendiği andan itibaren 12-16 saat içinde ışık mikroskobu altında görülebilir. Ayrıca, BODIPY C11 boyaması ve ardından PI boyama yöntemi kullanılarak lipid hidroperoksit birikimini ve bunun sonucunda hücre ölümünü göstermek için FACS analizi kullanılacaktır. Hücre ölümünün ferroptotik doğasını kanıtlamak için, ferrostatin-1 spesifik bir ferroptoz önleyici ajan olarak kullanılacaktır.
Introduction
Ferroptoz, yeni bağlamsallaştırılmış, reaktif oksijen türüne (ROS) bağımlı bir hücre ölümü türüdür1. ROS’un yanı sıra, demir bu tip hücre ölümünde çok önemli bir rol oynar, bu nedenle2 adı verilir. Ferroptozun son ve yürütücü adımı, plazma zarındaki lipitlerin oksidatif hasarının demir katalizli birikimidir ve bu da sonunda zar bütünlüğünün ve seçici geçirgenliğin bozulmasına ve son olarak köpürme yoluyla hücre ölümüne yol açar. Lipid hidroperoksidasyon olayı doğal olarak meydana gelen bir olgudur; Bununla birlikte, hücre zarı boyunca yayılması, hücrenin antioksidan savunması tarafından engellenir. Bu bağlamdaki ana oyuncu, zara yaklaşabilen ve lipid hidroperoksitleri daha az toksik alkol türevlerinedönüştürebilen Se-protein glutatyon peroksidaz 4’tür (GPx4). GPx4 için indirgeme gücü, esas olarak, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, esansiyel olmayan amino asitlerden oluşan bir tripeptit olan glutatyon (GSH) tarafından sağlanır: glisin, glutamat ve sistein. GSH’nin biyosentezi için hız sınırlayıcı amino asit sistein4’tür. Sistein, esansiyel olmayan bir amino asit olarak sınıflandırılmasına rağmen, gereksinimleri, yüksek oranda proliferatif hücrelerde (kanser hücreleri gibi) iç üretimini kolayca aşabilir. Bu nedenle yarı esansiyel amino asitler grubunda yeniden sınıflandırılmıştır. Gerekli sistein ithalatı, esas olarak, glutamat ihracatı pahasına oksitlenmiş (baskın) sistein (diğer adıyla sistin) formunun ithalatına izin veren Xc- sistemi yoluyla gerçekleşir5. Xc- sistemi, xCT olarak bilinen Na+’dan bağımsız, Cl’ye bağımlı bir taşıma alt biriminden ve CD98 olarak bilinen bir şaperon alt biriminden oluşur. Yakın zamana kadar, xCT-GSH-GPx4 ekseninin anti-ferroptotik özellikleri benzersiz ve kopyalanamaz olarak görülüyordu6. Bununla birlikte, 2019 yılında, ubikinol (Koenzim Q10) ve rejeneratif enzimi – ferroptoz baskılayıcı protein 1’den (FSP1) oluşan alternatif bir anti-ferroptotik yol tanımlanmıştır 7,8. Kısa bir süre sonra, GTP siklohidrolaz-1 / tetrahidrobiopterin (GCH1 / BH4) içeren başka bir lipid hidroperoksit detoksifiye edici sistem bildirilmiştir9. Bununla birlikte, xCT-GSH-GPx4 ekseninin ferroptozun önlenmesindeki merkezi rolü sorgulanmamış gibi görünmektedir.
Son on yılda, ferroptoz, çeşitli tümör tiplerinde kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve bir anti-kanser stratejisi olarak büyük potansiyel göstermiştir (Lei ve ark.10 tarafından gözden geçirilmiştir). Ayrıca, konvansiyonel kemoterapötiklere karşı yüksek direnç sergileyen ve/veya metastaz yapma eğilimi gösteren kanser hücrelerinin, GPx4 11,12,13 inhibitörleri gibi ferroptoz indükleyicilerine şaşırtıcı derecede duyarlı olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, beyin tümörleri bağlamında, ferroptotik indükleyicilerin potansiyeli büyük ölçüde yeterince çalışılmamıştır. Bu tip hücre ölümü serebral iskemi-reperfüzyon hasarı14ve nörodejeneratif hastalıklar15 ile yakından ilişkili olsa da, beyin tümörleri bağlamındaki potansiyeli esas olarak en sık görülen malign kraniyoserebral tümör olan glioblastoma ile sınırlıdır (Zhuo ve ark.16 tarafından gözden geçirilmiştir). Öte yandan, en sık görülen malign pediatrik beyin tümörü ve çocukluk çağı mortalitesinin önde gelen nedenlerinden biri olan medulloblastomun ferroptoz indükleyicilerine duyarlılığı büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Bildiğimiz kadarıyla, ferroptoz ve medulloblastomu birbirine bağlayan hakemli literatür azdır. Bununla birlikte, bazı çalışmalar, demirin hem medulloblastoma hem de glioblastoma kanseri kök hücrelerinin (CSC’ler) hayatta kalmasında, çoğalmasında ve tümörjenik potansiyelinde çok önemli bir rol oynadığını ortaya koymuştur17,18 ve potansiyel olarak onları ferroptoz indüksiyonuna karşı daha savunmasız hale getirir. Bu özellikle önemlidir, çünkü medulloblastom, tümör kemorezistansı, yayılması ve nüksünden büyük ölçüde sorumlu gibi görünen CSC’lerin alt popülasyonu veya tümör başlatan/yayılan hücreler ile ünlüdür19.
Ferroptoz indüksiyonuna duyarlılık tipik olarak hücre ölümüne yol açabilecek veya yol açmayacak lipid hidroperoksit içeriği/birikimi ölçülerek araştırılır. En yaygın olarak kullanılan ferroptoz indükleyicileri (1) xCT taşıyıcı20’nin bir inhibitörü olan erastin, (2) GPx4 enzimi2’nin bir inhibitörü olan RSL3 ve/veya (3) ferro-amonyum sitrat (FAC) gibi demir donörleridir.21. Lipid hidroperoksit içeriği, indirgenmiş durumda 581/591 nm’de uyarma ve emisyon maksimumlarına sahip seçici prob BODIPY 581/591 C1122 kullanılarak değerlendirilir. Lipid hidroperoksitlerle etkileşim ve oksidasyon üzerine, prob uyarma ve emisyon maksimumlarını 488/510 nm’ye kaydırır. Tipik olarak, lipid hidroperoksit içeriğinde önemli bir artış ferroptotik hücre ölümünden önce gelir. Ferroptoz programlanmış bir hücre ölümü olmadığından, yürütülmesine yol açan moleküler bir sinyal kaskadı yoktur. Bu nedenle, bunu doğrulamanın tek yolu, lipid hidroperoksit içeriğini izlemek ve bu tip hücre ölümü için ferrostatin 123 gibi spesifik inhibitörler kullanmaktır. Ferrostatin 1, hücrenin lipit bölmesine nüfuz edebilen ve lipit hidroperoksitleri detoksifiye edebilen ve böylece ferroptotik olayları önleyen lipofilik bir antioksidandır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ferroptotik hücre ölümünün birincil ayırt edici özelliği, plazma zarında kontrolsüz lipid hidroperoksit birikimidir. Bu oksidatif hasar, enzimatik veya enzimatik olmayan bir şekilde ortaya çıkabilir, ancak her iki durumda da reaksiyon demire bağımlı / katalizlidir, bu da bu tip hücre ölümünün adını açıklar. Lipid hidroperoksidasyonu genellikle 4-hidroksi-2,3-trans-nonenal (4-HNE) veya malonaldehit (MDA) gibi lipid hidroperoksidasyonunun bozunma ürünlerinin ölçülmesiyle dolaylı olarak tahmin…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Monako Prensliği hükümetinin yanı sıra ‘Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer’ (GEMLUC) ve BD FACS Melody satın alımı için gerekli araçları sağlayan Flavien Vakfı tarafından desteklendi.
Materials
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
Referenzen
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Meister, A., Anderson, M. E. Glutathione. Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).
- Lewerenzm, J., et al. The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Bersuker, K., et al. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature. 575, 688-692 (2019).
- Doll, S., et al. FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature. 575, 693-698 (2019).
- Hu, Q., et al. Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis. Front Cell Dev Biol. 10, (2022).
- Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer. Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).
- Viswanathan, V. S., et al. Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature. 547, 453-457 (2017).
- Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer. Redox Biol. 37, 101697 (2020).
- Hangauer, M. J., et al. Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature. 551, 247-250 (2017).
- Zhang Tuo, Q., et al. Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal Transduct Target Ther. 7, 59 (2022).
- Sun, Y. Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 14, (2022).
- Zhuo, S. Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges. Front Mol Biosci. 9, (2022).
- Bisaro, B. Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma. Mol Cell Ther. 3, 8 (2015).
- Schonberg, D. L., et al. Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells. Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).
- Werbowetski-Ogilvie, T. E. From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma. FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).
- Dixon, S. J. Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. Elife. 3, e02523 (2014).
- Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells. Cell Death Dis. 4, e592 (2013).
- Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology. Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).
- Miotto, G. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1. Redox Biol. 28, 101328 (2020).
- Daher, B. Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses. Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).
- Shimada, K. Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis. Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).
- Yang, W. S. Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).
- Gaschler, M. M. FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation. Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).
- Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death. Elife. 7, e37503 (2018).
- Cheloni, G., Slaveykova, V. I. Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry. Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).
- Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma. Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).
- Sato, M., et al. The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin’s cytotoxicity in cancer cells. Sci Rep. 8, 968 (2018).
- Cheff, D. M., et al. The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1. Redox Biol. 62, 102703 (2023).
- Wang, C., et al. Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect. Eur J Med Chem. 247, 115072 (2023).
- Vucetic, M., et al. Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis. Cell Death Dis. 11, 789 (2020).
- Meira, W., et al. A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers (Basel). 13 (6), 1434 (2021).
.