חשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי של מדולובלסטומה
Summary
תכולת הידרופרוקסיד שומנים מייצגת את האינדיקטור הנפוץ ביותר למוות של תאים פרופטוטיים. מאמר זה מדגים את ניתוח ציטומטריית הזרימה שלב אחר שלב של תכולת הידרופראוקסיד שומנים בתאים עם השראת פרופטוזיס.
Abstract
האינטראקציה של ברזל וחמצן היא חלק בלתי נפרד מהתפתחות החיים על פני כדור הארץ. עם זאת, כימיה ייחודית זו ממשיכה לרתק ולתהות, ומובילה למיזמים ביולוגיים חדשים. בשנת 2012, קבוצה מאוניברסיטת קולומביה הכירה באינטראקציה זו כאירוע מרכזי המוביל לסוג חדש של מוות תאי מווסת בשם “פרופטוזיס”. המאפיין העיקרי של פרופטוזיס הוא הצטברות של הידרופרוקסידים ליפידים עקב (1) הגנה נוגדת חמצון לא מתפקדת ו / או (2) עקה חמצונית מוחצת, אשר לרוב עולה בקנה אחד עם תוכן מוגבר של ברזל חופשי בתא. זה נמנע בדרך כלל על ידי הציר האנטי-פרופטוטי הקנוני הכולל את טרנספורטר הציסטין xCT, גלוטתיון (GSH) ו- GSH peroxidase 4 (GPx4). מכיוון שפרופטוזיס אינו סוג מתוכנת של מוות תאי, הוא אינו כרוך במסלולי איתות האופייניים לאפופטוזיס. הדרך הנפוצה ביותר להוכיח סוג זה של מוות תאי היא באמצעות נוגדי חמצון ליפופיליים (ויטמין E, ferrostatin-1, וכו ‘) כדי למנוע את זה. מולקולות אלה יכולות להתקרב ולסלק נזקי חמצון בקרום הפלזמה. היבט חשוב נוסף בחשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי הוא זיהוי הצטברות קודמת של הידרופרוקסידים ליפידים, שעבורם משתמשים בצבע הספציפי BODIPY C11. כתב היד הנוכחי יראה כיצד ניתן לגרום לפרופטוזיס בתאי מדולובלסטומה מסוג בר באמצעות השראות שונות: ארסטין, RSL3 ותורם ברזל. באופן דומה, ייעשה שימוש בתאי xCT-KO שגדלים בנוכחות NAC, ועוברים פרופטוזיס לאחר הסרת NAC. הפנוטיפ ה”מבעבע” האופייני נראה תחת מיקרוסקופ האור תוך 12-16 שעות מרגע הפעלת הפרופטוזיס. יתר על כן, ייעשה שימוש בצביעת BODIPY C11 ואחריה ניתוח FACS כדי להראות הצטברות של הידרופרוקסידים ליפידים ומוות תאים כתוצאה מכך באמצעות שיטת צביעת PI. כדי להוכיח את האופי הפרופטוטי של מוות תאי, ferrostatin-1 ישמש כסוכן ספציפי המונע פרופטוזיס.
Introduction
פרופטוזיס (Ferroptosis) הוא סוג חדש של חמצן תגובתי (ROS) התלוי במוות תאי1. מלבד ROS, ברזל ממלא תפקיד מכריע בסוג זה של מוות תאי, ומכאן השם2. השלב האחרון והביצועי של פרופטוזיס הוא הצטברות ברזל של נזק חמצוני של שומנים בקרום הפלזמה שבסופו של דבר מוביל לפגיעה בשלמות הממברנה וחדירות סלקטיבית, ולבסוף, מוות תאי על ידי בעבוע. אירוע הידרופרוקסידציה של שומנים הוא תופעה טבעית; עם זאת, התפשטותו ברחבי קרום התא נמנעת על ידי ההגנה נוגדת החמצון של התא. השחקן העיקרי בהקשר זה הוא חלבון Se גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPx4), שיכול להתקרב לממברנה ולהמיר הידרופרוקסידים ליפידים לנגזרות האלכוהול הפחות רעילות שלהם3. כוח ההפחתה של GPx4 מסופק בעיקר, אך לא רק, על ידי גלוטתיון (GSH), טריפפטיד המורכב מחומצות אמינו לא חיוניות: גליצין, גלוטמט וציסטאין. חומצת האמינו המגבילה את קצב הביוסינתזה של GSH היא ציסטאין4. למרות ציסטאין מסווג כחומצת אמינו לא חיונית, הדרישות שלה יכול בקלות לחרוג הייצור הפנימי שלה בתאים שגשוג מאוד (כגון תאים סרטניים). לפיכך הוא סווג מחדש בקבוצה של חומצות אמינו חיוניות למחצה. היבוא הדרוש של ציסטאין מתרחש בעיקר באמצעות מערכת Xc, המאפשרת יבוא של צורה מחומצנת (דומיננטית) של ציסטאין (aka ציסטין) על חשבון ייצוא גלוטמט5. מערכת Xc מורכבת מתת-יחידת תעבורה תלוית Cl-עצמאית Na+, המכונה xCT, ומתת-יחידה מלווה, המכונה CD98. עד לאחרונה, התכונות האנטי-פרופטוטיות של ציר xCT-GSH-GPx4 נתפסו כייחודיות ובלתי ניתנות לשכפול6. עם זאת, בשנת 2019תואר מסלול אנטי-פרופטוטי חלופי, המורכב מיוביקווינול (קואנזים Q10) והאנזים הרגנרטיבי שלו – חלבון מדכא פרופטוזיס 1 (FSP1), 7,8. זמן קצר לאחר מכן, דווח על מערכת ניקוי רעלים נוספת של הידרופראוקסיד שומנים הכוללת GTP cyclohydrolase-1/tetrahydrobiopterin (GCH1/BH4)9. עם זאת, נראה כי תפקידו המרכזי של ציר xCT-GSH-GPx4 במניעת פרופטוזיס אינו מאותגר.
במהלך העשור האחרון, ferroptosis נחקר בהרחבה במגוון סוגי גידולים, מראה פוטנציאל גדול כאסטרטגיה אנטי סרטנית (נסקר על ידי Lei et al.10). יתר על כן, דווח כי תאים סרטניים המפגינים עמידות גבוהה לכימותרפיה קונבנציונלית ו / או נטייה לשלוח גרורות רגישים באופן מפתיע להשראת פרופטוזיס, כגון מעכבי GPx4 11,12,13. עם זאת, בהקשר של גידולי מוח, הפוטנציאל של גורמים פרופטוטיים נותר במידה רבה לא נחקר. בעוד שסוג זה של מוות תאי נקשר קשר קשר הדוק עם פגיעה באיסכמיה מוחית14ומחלות נוירודגנרטיביות15, הפוטנציאל שלו בהקשר של גידולי מוח הוגבל בעיקר לגליובלסטומה, הגידול הממאיר הממאיר ביותר (נסקר על ידי Zhuo et al.16). מצד שני, הרגישות של מדולובלסטומה, הגידול הממאיר השכיח ביותר במוח בילדים וגורם מוביל לתמותה בילדות, לגורמים לפרופטוזיס עדיין לא נחקרה במידה רבה. למיטב ידיעתנו, קיימת ספרות מועטה שעוברת ביקורת עמיתים המקשרת בין פרופטוזיס למדולובלסטומה. עם זאת, כמה מחקרים גילו כי ברזל ממלא תפקיד מכריע בהישרדות, התפשטות ופוטנציאל גידולי של תאי גזע סרטניים מדולובלסטומה וגליובלסטומה (CSC)17,18, מה שעלול להפוך אותם לפגיעים יותר להשראת פרופטוזיס. זה משמעותי במיוחד מכיוון שמדולובלסטומה ידועה לשמצה בתת-האוכלוסייה שלה של CSCs, או תאים יוזמים/מתפשטים של גידולים, שנראה כי הם אחראים במידה רבה לעמידות לכימותרפיה, הפצה והישנות19.
רגישות להשראת פרופטוזיס נחקרת בדרך כלל על ידי מדידת תכולת/הצטברות שומנים הידרופרוקסידים, אשר עשויה להוביל למוות תאי או לא. הגורמים הנפוצים ביותר להשראת פרופטוזיס הם (1) ארסטין, מעכב של טרנספורטר xCT20,(2) RSL3, מעכב של האנזים GPx42, ו/או (3) תורמי ברזל, כגון פרו-אמוניום ציטראט (FAC)21. תכולת הידרופרוקסיד שומנים מוערכת באמצעות הבדיקה הסלקטיבית BODIPY 581/591 C1122, שיש לה עירור ופליטה מקסימלית ב 581/591 ננומטר במצבו המופחת. עם אינטראקציה וחמצון על ידי הידרופרוקסידים ליפידים, הגשושית מעבירה את העירור והפליטה המקסימלית שלה ל 488/510 ננומטר. בדרך כלל, עלייה משמעותית בתכולת הידרופרוקסיד שומנים קודמת למוות של תאים פרופטוטיים. מכיוון שפרופטוזיס אינו מוות תאי מתוכנת, אין מפל איתות מולקולרי המוביל לביצועו. לכן, הדרך היחידה לאשר את זה היא לפקח על תוכן hydroperoxide שומנים ולהשתמש מעכבים ספציפיים עבור סוג זה של מוות התא, כגון ferrostatin 123. Ferrostatin 1 הוא נוגד חמצון ליפופילי שיכול לחדור את תא השומנים של התא ולסלק hydroperoxides שומנים, ובכך למנוע אירועים ferroptotic.
Protocol
Representative Results
Discussion
סימן ההיכר העיקרי של מוות תאי פרופטוטי הוא הצטברות בלתי מבוקרת של הידרופרוקסידים ליפידים בקרום הפלזמה. נזק חמצוני זה עלול להתרחש באופן אנזימטי או לא אנזימטי, אך בכל מקרה, התגובה תלויה בברזל/מזורזת, מה שמסביר את שמו של סוג זה של מוות תאי. הידרופרוקסידציה של שומנים מוערכת לעתים קרובות בעקיפי…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ממשלת נסיכות מונקו, כמו גם על ידי “Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer” (GEMLUC) וקרן פלביאן, שסיפקה את האמצעים לרכישת BD FACS Melody.
Materials
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
Referenzen
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Meister, A., Anderson, M. E. Glutathione. Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).
- Lewerenzm, J., et al. The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Bersuker, K., et al. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature. 575, 688-692 (2019).
- Doll, S., et al. FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature. 575, 693-698 (2019).
- Hu, Q., et al. Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis. Front Cell Dev Biol. 10, (2022).
- Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer. Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).
- Viswanathan, V. S., et al. Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature. 547, 453-457 (2017).
- Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer. Redox Biol. 37, 101697 (2020).
- Hangauer, M. J., et al. Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature. 551, 247-250 (2017).
- Zhang Tuo, Q., et al. Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal Transduct Target Ther. 7, 59 (2022).
- Sun, Y. Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 14, (2022).
- Zhuo, S. Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges. Front Mol Biosci. 9, (2022).
- Bisaro, B. Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma. Mol Cell Ther. 3, 8 (2015).
- Schonberg, D. L., et al. Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells. Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).
- Werbowetski-Ogilvie, T. E. From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma. FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).
- Dixon, S. J. Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. Elife. 3, e02523 (2014).
- Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells. Cell Death Dis. 4, e592 (2013).
- Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology. Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).
- Miotto, G. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1. Redox Biol. 28, 101328 (2020).
- Daher, B. Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses. Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).
- Shimada, K. Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis. Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).
- Yang, W. S. Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).
- Gaschler, M. M. FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation. Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).
- Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death. Elife. 7, e37503 (2018).
- Cheloni, G., Slaveykova, V. I. Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry. Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).
- Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma. Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).
- Sato, M., et al. The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin’s cytotoxicity in cancer cells. Sci Rep. 8, 968 (2018).
- Cheff, D. M., et al. The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1. Redox Biol. 62, 102703 (2023).
- Wang, C., et al. Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect. Eur J Med Chem. 247, 115072 (2023).
- Vucetic, M., et al. Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis. Cell Death Dis. 11, 789 (2020).
- Meira, W., et al. A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers (Basel). 13 (6), 1434 (2021).
.