mStrawberry OP9细胞允许所有从联合培养的ES衍生后代的完整的评价。
在体外诱导分化的ES细胞向造血细胞的命运是非常有用的,学习时,很难在体内和表征最早的基因参与造血,而无需处理与胚胎lethalities访问的细胞群。 ES/OP9共培养体系最初的设计到生产没有对生产的巨噬细胞的造血后代,OP9基质细胞系是从颅骨骨质突变小鼠缺乏功能的M – CSF所得。可用于以总结早期造血发展,在体外ES/OP9共培养体系。 OP9基质细胞培养时,ES细胞分化成FLK – 1 +血管细胞,造血祖细胞,并终于成熟了,终末分化谱系。标准ES/OP9文化合作协议涉及到OP9细胞融合层的ES细胞的位置,以及定期replating的步骤,以删除旧的,污染OP9细胞。此外,目前的协议涉及评估,悬浮液中发现的的造血干细胞和分化的每一天不ES衍生后代的评价优化。然而,随着replating步骤和收获的只有悬浮细胞,可能错过了大量的ES衍生的后代和发展造血干细胞的部分。这个问题就变得很重要,以解决尝试,表征与基因敲除ES线相关的造血缺陷时。在这里,我们描述了修改后的ES / mStrawberry OP9共同的文化,可以消除污染下游检测OP9细胞。这种方法允许所有天共培养ES衍生后代的完整的评估,导致造血分化格局,更直接对应于观察胚胎内的造血分化格局。
正确mStrawberry OP9细胞的Flk1 +血管细胞共培养5天的生产结果的汇合层上的ES细胞的分化。血管细胞应该会出现堆积起来的,在图1观察细胞的旋涡。其余共培养,可见ES衍生的后代应该出现的造血干细胞群(图1)。在第六天/ 7两到四个细胞团应该会出现和生长成较大的细胞团(壁和悬浮)共培养8 / 9日。其他ES衍生后代中也发现,紧紧地贴壁的基质细胞层内的约束。
虽然没有在协议中列出,这是预测试的ES生长介质,mStrawberry OP9增长媒体和OP9分化的ES / mStrawberry媒体使用的胎牛血清的关键。正确的测试血清应确保mStrawberry OP9细胞的正常生长,以及在联合培养的ES细胞的正常分化,直到5日的分化。 OP9细胞作为替代方案,除了mStrawberry OP9细胞,可照射,在8000拉德,前汇合播种(7.8×10 4个细胞/ 厘米 2) 。 OP9细胞照射可以消除重复replating步骤,以及允许,几乎完全消除旧,污染下游检测OP9细胞。
OP9细胞工程3ug/mL了CMV启动子控制下的mStrawberry(pRRLsin CMV载体,加州大学洛杉矶分校的载体核心)的慢病毒表达载体转导与OP9细胞表达mStrawberry的蛋白质。
标准ES/OP9文化合作协议涉及到一个融合层OP9细胞胚胎干细胞的位置,以及一个5天replating步骤,以减少老污染OP9细胞传代细胞。此外,只有造血干细胞悬浮液中发现评价ES衍生后代都将被删除。然而,一个replating一步,只有悬浮细胞的收获之一可能错过了发展中的大量ES衍生的造血细胞。这个问题就变得很重要,以解决尝试,表征与基因敲除ES线相关的造血缺陷时。为了规避这个问题,我们的实验室使用了修改后的共同文化,通过使用mStrawberry OP9细胞表达。这可以保证所有的ES后代在5天的继续合作文化,并为所有下游的检测ES衍生后代的收获。此修改提供一个有用的工具,从人类和小鼠ES线衍生的造血后代的评价和表征。
这ES – mStrawberry OP9共培养模型概括的各个阶段,原始的和明确的造血。在研究造血发育的早期阶段,许多人使用的BL – CFC(爆炸般的集落形成细胞)检测,评估ES细胞hemangioblast的发展。虽然BL – CFC检测是一个有用的工具,在调查早期造血发展,共培养系统的mStrawberry – ES展品增加实用工具,因为它允许hemangioblast评估,以及,更多的成人造血谱系。
以前的工作,使用传统OP9/ES和EB分化协议表明,也许有必要,如HOXB4过度表达,为了额外的因素得到长期的复育造血干细胞在体外。更多的工作是必要的,以评估是否mStrawberry负,排序ES衍生的人群中真正的造血干细胞。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢美国Ganapati mStrawberry OP9细胞株的建立和测试。此外,我们感谢H. Shafifor与她共培养援助。惠普的支持,从国家心脏,肺和血液研究所(F31HL087714)(惠普)的奖学金。这项工作的内容完全是作者的责任,并不一定代表的国家心脏,肺和血液研究所或美国国立卫生研究院(NIH)的官方意见。加州大学洛杉矶分校的流式细胞仪核心设施是由美国国立卫生研究院(CA – 16042,AI – 28697),琼森癌症中心,加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所,加州大学洛杉矶分校医学学院的支持。
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |