mStrawberry OP9 hücreleri ko-kültür tüm ES-türetilen döl tam değerlendirme için izin verir.
In vivo ve embriyonik lethalities ile uğraşmak zorunda kalmadan, hematopoez dahil erken genleri tanımlamak için ulaşılması zor olan hücre popülasyonlarının çalışılırken, hematopoetik hücre kaderinin doğru ES hücrelerinin in vitro farklılaşması yararlıdır . OP9 stromal hücre hattı M-CSF fonksiyonel eksikliği osteopetrosis mutant farelerin calvaria türetilen ES/OP9 ko-kültür sisteminin ilk olarak makrofajların aşırı üretim olmadan, hematopoetik döl üretmek için dizayn edilmiştir. In vitro ES/OP9 ko-kültür sisteminde erken hematopoetik gelişimi özetlemek amacıyla kullanılabilir. OP9 stromal hücrelerinin kültüre, ES hücreleri FLK-1 + hemangioblasts, hematopoetik atalarıdır ve nihayet olgun, terminal farklılaşmış soy farklılaşırlar. Standart ES/OP9 ko-kültür protokolü OP9 hücrelerinin konfluent tabakası üzerine ES hücrelerinin yerleştirme gerektirir; OP9 hücreleri kirlenmesine neden olan, eski kaldırmak için yanı sıra, periyodik replating adımları. Ayrıca, mevcut protokolleri sadece süspansiyon bulundu hematopoetik hücrelerin değerlendirilmesi ve farklılaşma her gün ES-kökenli döl değerlendirilmesi için optimize edilmiş değildir. Ancak, adımları ve sadece süspansiyon hücrelerinin hasat replating bir potansiyel ES-kökenli döl ve hematopoietik hücreleri gelişmekte olan büyük bir bölümünü özlüyor. Bu sorun, nakavt ES hatları ile ilgili hematopoetik kusurları karakterize etmek için çalışırken ele almak önem kazanmaktadır. Burada downstream deneyleri OP9 hücre kirlenmesine neden ortadan kaldırılması için izin veren bir değiştirilmiş ES / mStrawberry OP9 ko-kültür, açıklar. Bu yöntem, embriyo içinde gözlenen hematopoetik farklılaşma desen daha doğrudan karşılık gelen bir hematopoetik farklılaşma desen, tam bir değerlendirme için, eş-kültür her gün tüm ES-türetilen döl verir.
Eş-kültür Gün 5 Flk1 + hemangioblasts üretiminde mStrawberry OP9 hücreleri sonuçları konfluent katman üzerinde ES hücrelerinin doğru farklılaşma. Hemangioblasts Şekil 1'de görüldüğü gibi hücre loca gibi yığılı görünmelidir. Co-kültür geri kalanı için, görünür ES-türetilen döl hematopoetik hücre kümeleri (Şekil 1) olarak görünmelidir. Gün6 7 / 03:58 hücre kümeleri görünmelidir ve co-kültür Günü 8 / 9 büyük bir hücre kümeleri (yapışık ve süspansiyon) içine büyümeye. Diğer ES türetilen döl sıkıca yapışık stromal hücre katmanı içinde bağlı bulunmaktadır.
Protokolde yer olmasa da, FBS ES büyüme ortamı, mStrawberry OP9 büyüme ortamı ve ES / mStrawberry OP9 farklılaşma medya kullanılan ön test için kritik öneme sahiptir. Düzgün serum ko-kültür uygun mStrawberry OP9 hücrelerinin büyüme yanı sıra, ES hücreleri düzgün farklılaşma farklılaşma Gün 5 kadar emin olmalıdır test edilmiştir. MStrawberry OP9 hücrelere ek olarak, alternatif olarak veya OP9 hücreleri (7.8×10 4 hücre / cm 2) confluency ekim öncesinde, 8000 rad, ışınlanmış olabilir. OP9 hücreleri ışınlanması downstream deneyleri OP9 hücre kirlenmesine neden olan, neredeyse tamamen ortadan kaldırılması için eski sağlar yanı sıra, tekrarlanan replating adımları ortadan kaldırılması için izin verir.
OP9 hücreleri CMV organizatörü (pRRLsin CMV vektör, UCLA vektör çekirdek) kontrolü altında bir lentiviral vektör ifade mStrawberry 3ug/mL OP9 hücreleri uyum mStrawberry protein ifade etmek için tasarlanmıştır.
Standart ES/OP9 ko-kültür protokolleri yanı sıra, OP9 hücreleri hücre geçit kirlenmesine, eski azaltmak amacıyla, bir konfluent katmanı OP9 hücreleri üzerine bir gün 5 replating adım ES hücrelerinin yerleştirilmesi gerektirecektir. Ayrıca, sadece süspansiyon bulundu hematopoetik hücreler ES-kökenli döl değerlendirilmesi için kaldırılır. Ancak, bir replating sadece süspansiyon hücrelerinin adım ve hasat ile bir potansiyel, gelişmekte olan önemli sayıda ES-kaynaklı hematopoetik hücreler özlüyor. Bu sorun, nakavt ES hatları ile ilgili hematopoetik kusurları karakterize etmek için çalışırken ele almak önem kazanmaktadır. Bu sorunu aşmak için amacıyla laboratuvar OP9 hücreleri mStrawberry ifade kullanımı yoluyla değiştirilmiş bir ko-kültür kullanılır. Bu tüm ES döl 5 gün devam eden ko-kültür transfer olmasını sağlar, aşağı testleri için tüm ES-türetilen döl hasat için. Bu değişiklik, değerlendirme ve karakterizasyonu, insan ve fare ES hatları türetilen hematopoietik döl yararlı araçlar sağlar.
Çeşitli aşamalarında, ilkel ve kesin hematopoez Bu ES-mStrawberry OP9 ko-kültür modeli özetlediği. Hematopoetik gelişiminin erken evrelerinde incelerken, birçok kişi, ES hücre hemangioblast gelişimini değerlendirmek, BL-CFC (koloni oluşturan hücre Patlamaya gibi) testi kullanır. BL-CFC testinin erken hematopoetik gelişimi araştıran yararlı bir araçtır hemangioblast değerlendirilmesi yanı sıra, daha yetişkin hematopoetik soy sağlar mStrawberry-ES, ko-kültür sistemleri artış yardımcı programı sergiler.
Için, HoxB4, aşırı ekspresyonunun gibi, belki de gerekli ek faktörler hematopoietik kök hücrelerinin in vitro repopulating uzun vadeli elde etmek için, geleneksel OP9/ES ve EB farklılaşma protokolleri kullanarak Önceki iş göstermiştir. Ek iş mStrawberry negatif, ES-kökenli nüfus sıralaması doğru hematopoietik kök hücreleri içeren olup olmadığını değerlendirmek için gereklidir.
The authors have nothing to disclose.
Biz U. Ganapati mStrawberry OP9 hücre hattı kurulması ve test için teşekkür ederiz. Ayrıca, ko-kültür ile H. Shafifor ona yardım teşekkür ederim. HP, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (F31HL087714) (HP) bir arkadaş grubu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmanın içeriği yalnızca yazarın sorumluluğundadır ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) mutlaka resmi görüşlerini temsil etmemektedir. UCLA Sitometrisi Core Tesis NIH (CA-16.042 ve AI-28.697), Jonsson Kanser Merkezi, UCLA AIDS Enstitüsü ve UCLA Tıp Okulu tarafından desteklenmektedir.
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |