mStrawberry OP9 células permiten una evaluación completa de toda la progenie derivada de ES-co-cultivo.
La diferenciación in vitro de células madre embrionarias hacia un destino de células hematopoyéticas es útil cuando se estudian poblaciones celulares que son de difícil acceso en vivo y para la caracterización de los primeros genes que participan en la hematopoyesis, sin tener que lidiar con lethalities embrionarias. El co-cultivo ES/OP9 sistema fue diseñado originalmente para producir una progenie hematopoyética, sin el exceso de producción de los macrófagos, como la línea de células del estroma OP9 se deriva de la bóveda craneal de ratones mutantes que carecen de osteopetrosis funcional M-CSF. El in vitro ES/OP9 co-cultura del sistema se puede utilizar con el fin de recapitular el desarrollo hematopoyético temprano. Cuando se cultivan en OP9 las células del estroma, células madre embrionarias se diferencian en Flk-1 + hemangioblastos, progenitores hematopoyéticos, y, finalmente, madura, los linajes de diferenciación terminal. La norma ES/OP9 co-cultivo protocolo implica la colocación de células madre embrionarias en una capa confluente de células OP9, así como, las medidas periódicas replating con el fin de eliminar viejos, contaminantes OP9 células. Además, los protocolos actuales incluyen la evaluación sólo las células hematopoyéticas se encuentran en suspensión y no están optimizados para la evaluación de la ES-derivados de la progenie a cada día de la diferenciación. Sin embargo, con los pasos replating y la recolección de células en suspensión solo potencialmente pierde una gran parte de la progenie derivada de ES y el desarrollo de las células hematopoyéticas. Este problema se vuelve importante para hacer frente al tratar de caracterizar los defectos asociados con las líneas hematopoyéticas ES octavos de final. Aquí se describe una modificación ES / mStrawberry OP9 co-cultivo, lo que permite la eliminación de contaminantes OP9 las células de los ensayos de aguas abajo. Este método permite la evaluación completa de toda la progenie derivada de ES en todos los días de co-cultivo, resultando en un patrón de diferenciación hematopoyética, lo que más se corresponde directamente con el patrón de diferenciación hematopoyética observado en el embrión.
Diferenciación adecuada de células madre embrionarias en la capa confluente de células mStrawberry OP9 resultados en la producción de Flk1 hemangioblastos + en el día 5 de co-cultivo. Hemangioblastos debe aparecer como amontonados espirales de células, como se observa en la Figura 1. Para el resto de los compañeros de la cultura, visibles ES derivados de descendencia debería aparecer como grupos de células hematopoyéticas (Figura 1). En Day6 / 7 desde dos hasta cuatro grupos de células que aparecen y se desarrollan en grupos de células grandes (tanto en adherentes y en suspensión) en el Día 8 / 9 de co-cultivo. ES progenie derivada también se encuentran otros estrechamente ligadas dentro de la capa de células del estroma adherentes.
Aunque no figure en el protocolo, es fundamental poner a prueba el FBS utilizada en el medio de cultivo ES, el mStrawberry OP9 medios de cultivo y el ES / mStrawberry OP9 medio de diferenciación. Sometidos a las pruebas de suero debe garantizar un adecuado crecimiento de mStrawberry OP9 células, así como, la diferenciación correcta de las células madre embrionarias en el co-cultivo hasta el día 5 de diferenciación. Como alternativa o como complemento de mStrawberry OP9 células, OP9 células pueden ser irradiados, a 8000 rads, antes de la siembra en la confluencia (7.8×10 4 células / cm 2). La irradiación de células OP9 permite la eliminación de los repetidos pasos replating, así como, permite la eliminación casi completa de los viejos, contaminantes OP9 las células de los ensayos de aguas abajo.
OP9 células fueron modificadas para expresar la proteína de transducción OP9 mStrawberry por células con 3ug/mL de un mStrawberry vector lentiviral expresar bajo el control de un promotor CMV (CMV-pRRLsin vector, vector principal de la UCLA).
ES/OP9 estándar de co-cultivo protocolos implican la colocación de células madre embrionarias en un confluente capa OP9 células, así como, un día 5 pasos replating con el fin de reducir la edad, la contaminación de OP9 células del paso de la célula. Además, sólo las células hematopoyéticas se encuentran en suspensión se eliminan para la evaluación de la ES-derivados progenie. Sin embargo, tanto con un paso replating y la recolección de células en suspensión sólo una falla potencialmente un número importante de los países en desarrollo ES derivados de las células hematopoyéticas. Este problema se vuelve importante para hacer frente al tratar de caracterizar los defectos asociados con las líneas hematopoyéticas ES octavos de final. Con el fin de eludir este problema nuestro laboratorio utiliza una versión modificada de co-cultivo, mediante el uso de mStrawberry que expresan las células OP9. Esto asegura que toda la progenie ES se transfieren a la continua cooperación de la cultura en el día 5, y para la cosecha de toda la progenie derivada de ES para los ensayos de aguas abajo. Esta modificación ofrece una herramienta útil en la evaluación y caracterización de la progenie hematopoyéticas derivadas de humanos y líneas de ratones ES.
Este ES-mStrawberry OP9 cultura co-modelo las diferentes etapas primitivas y la hematopoyesis definitiva recapitula. Al estudiar las primeras etapas de desarrollo hematopoyético, muchas personas utilizan el BL-CFC (Blast-similares a las células formadoras de colonias) de ensayo, que evalúan el desarrollo de la hemangioblasto de la célula ES. Mientras que el ensayo BL-CFC es una herramienta útil en la investigación de desarrollo hematopoyético temprano, el mStrawberry-ES co-cultivo de sistemas de servicios públicos presenta aumento, ya que permite la evaluación de hemangioblasto, así como, los linajes hematopoyéticos más adulto.
El trabajo previo con OP9/ES tradicionales y los protocolos de diferenciación de EB ha demostrado que los factores adicionales tal vez sea necesario, como la sobreexpresión de HOXB4, a fin de obtener a largo plazo repoblar las células madre hematopoyéticas in vitro. El trabajo adicional es necesario para evaluar si mStrawberry negativos, ordenados ES derivados de las poblaciones contienen verdaderas células madre hematopoyéticas.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a U. Ganapati para el establecimiento y pruebas de la línea celular mStrawberry OP9. Además, agradecemos a H. Shafifor su ayuda con el co-cultivo. HP es apoyado por una beca del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (F31HL087714) (HP). El contenido de esta obra es de la exclusiva responsabilidad del autor y no necesariamente representa la posición oficial del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre o de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El flujo de UCLA Citometría Core Facility es apoyado por el NIH (CA-16042 y AI-28697), el Centro del Cáncer Jonsson, el Instituto de SIDA de UCLA, y la Escuela de Medicina de UCLA.
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |