mStrawberry OP9 células permitir uma avaliação completa de todos os descendentes ES-derivados de co-cultura.
A diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias para um destino de células hematopoiéticas é útil quando se estuda populações de células que são de difícil acesso e in vivo para caracterizar os primeiros genes envolvidos na hematopoiese, sem ter que lidar com letalidades embrionárias. O ES/OP9 sistema de co-cultura foi originalmente projetada para produzir progênie hematopoiéticas, sem o excesso de produção de macrófagos, como a linha de células do estroma OP9 é derivada da calvária de ratos mutantes osteopetrose que a falta funcional M-CSF. A in vitro ES/OP9 sistema de co-cultura pode ser usado, a fim de recapitular desenvolvimento hematopoiético cedo. Quando cultivadas em OP9 células do estroma, células-tronco embrionárias se diferenciam em Flk-1 + hemangioblastos, progenitores hematopoiéticos e, finalmente, maduro, linhagens terminalmente diferenciadas. O padrão ES/OP9 protocolo de co-cultura implica a colocação de células-tronco embrionárias em uma camada confluente de células OP9, bem como, periódicos passos repique, a fim de remover o velho, contaminando OP9 células. Além disso, os protocolos atuais envolvem avaliar apenas as células hematopoiéticas, encontradas na suspensão e não são otimizados para a avaliação da ES-derivados de progênie em cada dia de diferenciação. No entanto, com passos repique ea colheita de células em suspensão apenas um potencialmente perde uma grande parte ES derivadas progênie e desenvolvimento de células hematopoiéticas. Esta questão torna-se importante abordar quando se tenta caracterizar defeitos hematopoiéticas associadas com linhas ES nocaute. Aqui nós descrevemos uma versão modificada ES / mStrawberry OP9 co-cultura, que permite a eliminação de contaminantes OP9 células de ensaios a jusante. Este método permite a avaliação completa de todas as progênies derivadas ES em todos os dias de co-cultura, resultando em um padrão de diferenciação hematopoiética, que mais directamente corresponde ao padrão de diferenciação hematopoiética observado dentro do embrião.
Diferenciação adequada de células ES na camada confluente de mStrawberry OP9 células resulta na produção de Flk1 hemangioblastos + no dia 5 de co-cultura. Hemangioblastos deve aparecer como amontoados espirais de células, como observado na Figura 1. Para o restante da co-cultura, da progênie ES derivadas visível deve aparecer como aglomerados de células hematopoiéticas (Figura 1). No Day6 / 7 03:58 grupamentos celulares deve aparecer e crescer em clusters célula maior (tanto aderentes e em suspensão) no dia 09/08 de co-cultura. Progênie ES outros derivados também são encontrados fortemente ligada dentro da camada de células aderentes do estroma.
Embora não incluída no protocolo, é essencial para pré-testar o FBS utilizado no meio de crescimento ES, o mStrawberry OP9 meios de crescimento e da ES / mStrawberry OP9 media diferenciação. Devidamente testados soro deve garantir um crescimento adequado de mStrawberry OP9 células, bem como, a diferenciação adequada de células ES em co-cultura até o dia 5 de diferenciação. Como uma alternativa ou para além mStrawberry OP9 células, OP9 células podem ser irradiados, em 8000 rads, antes da semeadura na confluência (7.8×10 4 células / cm 2). Irradiação de células OP9 permite a eliminação dos repetidos passos repique, bem como, permite a eliminação quase completa do velho, contaminando OP9 células de ensaios a jusante.
OP9 células foram projetadas para expressar a proteína mStrawberry transduzindo OP9 células com 3ug/mL de um vector lentiviral mStrawberry expressar sob o controle de um promotor CMV (CMV pRRLsin-vector, vector UCLA core).
Padrão ES/OP9 co-cultura protocolos implica a colocação de células-tronco embrionárias em uma camada confluente OP9 células, bem como, um dia passo replating 5, a fim de reduzir a idade, contaminando OP9 células de passagem de célula. Além disso, somente as células hematopoiéticas, encontradas em suspensão são removidos para a avaliação da ES derivadas progênie. No entanto, com tanto passo um repique ea colheita de células em suspensão potencialmente apenas um perde um número substancial de desenvolvimento ES-derivado células hematopoiéticas. Esta questão torna-se importante abordar quando se tenta caracterizar defeitos hematopoiéticas associadas com linhas ES nocaute. A fim de contornar este problema nosso laboratório usado uma versão modificada co-cultura, através do uso de mStrawberry expressando OP9 células. Isso garante que todos os descendentes ES são transferidos para o co-cultura continuou no dia 5, e para a colheita de todas as progênies derivadas ES para ensaios de downstream. Esta alteração prevê uma ferramenta útil na avaliação e caracterização de progênie hematopoiéticas derivadas de humanos e linhas ES mouse.
Este ES-mStrawberry OP9 co-cultura recapitula o modelo de vários estágios primitivos e hematopoiese definitiva. Ao estudar as fases iniciais do desenvolvimento hematopoiético, muitas pessoas usam a BL-CFC (Blast-como células formadoras de colônia) de ensaio, que avaliam o desenvolvimento do hemangioblast da célula ES. Enquanto o ensaio BL-CFC é uma ferramenta útil na investigação de desenvolvimento hematopoiético cedo, o mStrawberry-ES sistemas de co-cultura apresenta utilitário aumentar à medida que permite a avaliação da hemangioblast, bem como, mais adulto linhagens hematopoiéticas.
Trabalho anterior usando OP9/ES tradicionais e protocolos de diferenciação EB mostrou que fatores adicionais, talvez necessárias, como a superexpressão de HoxB4, a fim de obter a longo prazo repovoar células-tronco hematopoiéticas in vitro. Trabalho adicional é necessário avaliar se mStrawberry negativo, classificado ES derivadas populações contêm verdadeiras células-tronco hematopoéticas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a U. Ganapati para a criação e testes da linha celular mStrawberry OP9. Além disso, agradecemos H. Shafifor sua assistência com o co-cultura. HP é apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (F31HL087714) (HP). O conteúdo deste trabalho é da exclusiva responsabilidade do autor e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue ou o National Institutes of Health (NIH). O Fluxo UCLA Facility Núcleo Citometria é suportado pelo NIH (CA-16042 e AI-28697), o Jonsson Cancer Center, da UCLA AIDS Institute, e da Escola de Medicina da UCLA.
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |