Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Summary

Diese Methode zur Isolierung von funktionellen Immunzellen aus dem Herzen stellt eine Alternative zu den herkömmlichen Methoden der Kollagenaseverdau, die unerwünschten Immun-Zell-Aktivierung verursacht, was zu einer verminderten Reaktionsfähigkeit dieser Zellen. Unsere Methode der Isolierung ergibt funktionelle Herz-Immunzellen durch die Vermeidung von Problemen mit enzymatische Verdauung.

Abstract

Cardiac Immunzellen gewinnen Interesse für die Rollen, die sie spielen in den pathologischen Umbau in vielen Herzerkrankungen ^1-5 Diese Immunzellen, die Mastzellen, T-Zellen und Makrophagen gehören,. Speicherung und Freisetzung einer Vielzahl von biologisch aktiven Mediatoren einschließlich Zytokine und Proteasen wie Tryptase. ^6-8 Diese Mediatoren haben gezeigt, dass wichtige Akteure in der extrazellulären Matrix Stoffwechsel werden durch die Aktivierung Matrixmetalloproteinasen oder was Kollagenakkumulation durch Modulation der kardialen Fibroblasten-Funktion. ^9-11 Allerdings haben verfügbaren Techniken zur Isolierung von Herz-Immunzellen problematisch, weil sie bakterieller Kollagenase, um das Herzmuskelgewebe verdauen verwenden. Diese Technik bewirkt eine Aktivierung der Immunzellen und somit zu einem Verlust der Funktion. Zum Beispiel, kardiale Mastzellen deutlich weniger auf Verbindungen, die Degranulation führen werden. ¹² Darum entwickelten wir eine Technik, die für t erlaubtEr Isolation von funktionellen Herz-Immunzellen, die zu einem besseren Verständnis der Rolle dieser Zellen bei Herzerkrankungen führen würde. ^{13, 14}

Diese Methode erfordert eine gewisse Vertrautheit mit der anatomischen Lage der Ratte Xiphoidbasis, Achselhöhle und Lig. falciforme und Perikard des Herzens. Diese Landmarken sind wichtig für den Erfolg des Verfahrens zu erhöhen und eine höhere Ausbeute an Herz-Immunzellen zu gewährleisten. Diese isolierten kardialen Immunzellen können dann für die Charakterisierung der Funktionalität, Erscheinungsbild, Reife und Co-Kultur-Experimente mit anderen Herzzellen zu einem besseren Verständnis ihrer Wechselwirkungen zu gewinnen verwendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung Hanks 'Balance Salt Solution (HBSS) Autoclave 1 L Becherglas, absolvierte 1000 ml Zylinder und Rührstab. Bereiten Sie die HBSS Pulver Lösung im Autoklaven 1 L Becherglas auf die 900 mL Marke mit doppelt destilliertem Wasser. Mix HBSS-Lösung mit 3,4 g Hepes Na + Salz-und pH-Wert auf einen Wert zwischen 7,35-7,41 entweder mit konzentrierter HCL oder NaOH. Sobald der gewünschte pH erreicht ist und bleibt stabil, 5 g Rinderserumalbumin, um die Lösung bei Raum…

Discussion

Dieses Verfahren zur Isolierung von Herz-Immunzellen ermöglicht die Analyse ihrer Funktion, Phänotyp und Reife, ohne die ungewollte Aktivierung, die typischerweise während einer traditionellen enzymatische Verdauung Isolation Technik. Die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen mit dieser Technik erhält man rund 400.000 pro Ratte Herz und Differential-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse dieser Zellen zeigt gemischte Population von T-Lymphozyten (~ 70%), Makrophagen (~ 12%) und Mastzellen mit die Verwendung die…

Materials

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483