Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery
Summary
Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine des Zytoskeletts angewendet werden.
Abstract
Bakterielle Zellteilung erfordert die koordinierte Anordnung von mehr als zehn essentiellen Proteine bei midcell 1,2. Im Mittelpunkt dieses Verfahrens ist die Bildung eines ringähnlichen Suprastruktur (Z-Ring) durch die FtsZ Protein bei der Teilung Plan 3,4. Der Z-Ring besteht aus mehreren einsträngige FtsZ Protofilamenten, und das Verständnis der Anordnung der Protofilamente innerhalb der Z-Ring wird einen Einblick in den Mechanismus der Z-Ring Montage und ihrer Funktion als Krafterzeuger 5,6 geben. Diese Information ist bisher unklar in herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie und Elektronenmikroskopie aufgrund der aktuellen Einschränkungen. Konventionellen Fluoreszenzmikroskop ist nicht ein hochauflösendes Bild des Z-Ring aufgrund der Beugungsgrenze des Licht (~ 200 nm) bereitzustellen. Electron cryotomographic Bildgebung erkannt hat FtsZ Protofilamente in kleinen C. verstreut crescentus Zellen 7, ist jedoch schwierig, zu größeren Zellen wie geltenE. coli oder B. subtilis. Hier haben wir die Anwendung eines Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie-Methode zu beschreiben, Photoaktiviertes Localization Microscopy (PALM), quantitativ zu charakterisieren die strukturelle Organisation des E. coli Z-Ring 8.
PALM Bildgebung bietet sowohl eine hohe räumliche Auflösung (~ 35 nm) und spezifische Kennzeichnung für die eindeutige Identifizierung von Zielproteinen zu ermöglichen. Wir markierten FtsZ mit dem photoaktivierbaren Fluoreszenzprotein mEos2, die von grünen Fluoreszenz (Anregung = 488 nm) nach rot schaltet Fluoreszenz (Anregung = 561 nm) bei Aktivierung bei 405 nm 9. Während eines Experiments PALM werden einzelne FtsZ-mEos2 Moleküle stochastisch aktiviert und die entsprechenden Zentroidpositionen der einzelnen Moleküle sind mit <20 nm Genauigkeit bestimmt. Ein Super-Resolution-Bild der Z-Ring wird dann durch die Überlagerung der Zentroidpositionen aller erkannten FtsZ-mEos2 Moleküle rekonstruiert.
<p class = "jove_content"> Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass der Z-Ring einen festen Breite von ~ 100 nm aufweist und aus einem Bündel von losen FtsZ Protofilamenten, die miteinander überlappen, in drei Dimensionen besteht. Diese Daten liefern ein Sprungbrett für weitere Untersuchungen der Zellzyklus abhängigen Veränderungen der Z-Ring 10 und kann auf andere Proteine von Interesse angewendet werden.Protocol
Representative Results
Discussion
PALM Bilder enthalten Informationen über Molekül Zählungen und Positionen innerhalb einer Zelle, so dass detaillierte Analyse der Verteilung und Anordnung der Target-Protein-Moleküle, die nur schwer mit anderen Mitteln erreichen. Nachfolgend skizzieren wir Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um eine genaue quantitative Informationen zu extrahieren und gleichzeitig die biologische Relevanz der PALM Bilder werden sollte. Wir auch die Informationen, die am besten erhalten werden kann mit live vs fixierten Zellen. Schließli…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant: 5RO1GM086447-02.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
Referencias
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