Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica
Summary
Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine batteriche citoscheletro.
Abstract
Divisione cellulare batterica richiede il montaggio coordinato di più di dieci proteine essenziali alla midcell 1,2. Centrale di questo processo è la formazione di un anello simile sovrastruttura (Z-ring) dalla proteina FtsZ al piano di divisione 3,4. La-Z anello costituito da più singolo filamento protofilamenti FtsZ, e comprendere la disposizione dei protofilamenti all'interno Z-ring fornirà sul meccanismo di Z-ring e la sua funzione di generatore di forza 5,6. Questa informazione è rimasta inafferrabile a causa delle limitazioni attuali convenzionale microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica. Microscopia a fluorescenza convenzionale non è in grado di fornire una immagine ad alta risoluzione di Z-ring a causa del limite di diffrazione della luce (~ 200 nm). Electron cryotomographic di imaging ha rilevato sparsi protofilamenti FtsZ in piccole C. cellule crescentus 7, ma è difficile da applicare a grandi cellule qualiE. coli o B. subtilis. Qui si descrive l'applicazione di un metodo di risoluzione super-microscopia a fluorescenza, microscopia localizzazione fotoattivati (PALM), per caratterizzare quantitativamente l'organizzazione strutturale della E. coli Z-ring 8.
PALM offre sia immagini alta risoluzione spaziale (~ 35 nm) e un'etichettatura specifica per consentire l'identificazione univoca delle proteine bersaglio. Abbiamo etichettato FtsZ con il mEos2 fotoattivabile proteina fluorescente, che passa da verde a fluorescenza (eccitazione = 488 nm) al rosso fluorescenza (eccitazione = 561 nm) in caso di attivazione a 405 nm 9. Durante un esperimento PALM, singoli FtsZ-mEos2 molecole sono stocasticamente attivati e le corrispondenti posizioni centroide delle singole molecole sono determinati con <20 nm precisione. Un super-risoluzione di immagine di Z-ring viene poi ricostruita sovrapponendo le posizioni centroide di tutti i rilevati FtsZ-mEos2 molecole.
<p class = "jove_content"> Usando questo metodo, abbiamo trovato che la Z-anello ha una larghezza fissa di circa 100 nm ed è composto da un fascio di allentato protofilamenti FtsZ che si sovrappongono tra loro in tre dimensioni. Questi dati forniscono un trampolino per ulteriori indagini modifiche ciclo cellulare dipendenti della Z-ring 10 e può essere applicata ad altre proteine di interesse.Protocol
Representative Results
Discussion
Immagini PALM contengono informazioni sui conteggi molecola e posizioni all'interno di una cella, consente un'analisi dettagliata della distribuzione e la disposizione delle molecole proteiche bersaglio che è difficile da ottenere con altri mezzi. Di seguito si evidenzieranno le precauzioni che dovrebbero essere prese per estrarre informazioni quantitative precise, pur mantenendo la rilevanza biologica delle immagini PALM. Abbiamo anche esplorare le informazioni che possono essere meglio ottenuta utilizzando ce…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant: 5RO1GM086447-02.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
Referencias
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