Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Summary

Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.

Abstract

A divisão celular bacteriana requer a montagem coordenada de mais de dez proteínas essenciais para midcell ^1,2. Central neste processo é a formação de um anel supraestrutura-like (Z-ring) pela proteína FtsZ no plano de divisão ^3,4. O anel Z é constituída por múltiplas protofilamentos single-stranded FtsZ, e compreendendo o arranjo dos protofilamentos dentro do Z-ring irão fornecer indicações acerca do mecanismo de Z-anel de montagem e a sua função como um gerador de força de ^5,6. Esta informação permaneceu uma incógnita devido a limitações atuais em microscopia de fluorescência convencional e microscopia eletrônica. A microscopia de fluorescência convencional não é capaz de fornecer uma imagem de alta resolução do Z-ring devido ao limite de difracção de luz (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagem detectou espalhados protofilamentos FtsZ em C. pequena células crescentus ^7, mas é difícil de aplicar a células maiores, tais comoE. coli ou B. subtilis. Aqui, descrevemos a aplicação de um método de microscopia de fluorescência de super-resolução, microscopia fotoativados localização (PALM), para caracterizar quantitativamente a organização estrutural do E. coli Z-ring ^8.

PALM oferece imagens de alta resolução espacial (~ 35 nm) e rotulagem específica para permitir a identificação inequívoca de proteínas-alvo. Nós FtsZ rotulados com a proteína mEos2 fotoactivável fluorescente, a qual muda de verde de fluorescência (excitação = 488 nm) para vermelho de fluorescência (excitação = 561 nm) após a activação a 405 nm ^9. Durante uma experiência de palma, individuais FtsZ-mEos2 moléculas são estocasticamente activado e as posições correspondentes do centróide das moléculas individuais são determinadas com <precisão nm 20. Uma imagem de super-resolução do anel Z é então reconstruído por sobrepondo as posições de todos os centróide detectados FtsZ-mEos2 moléculas.

<p class = "jove_content"> Usando este método, verificou-se que o Z-ring tem uma largura fixa de ~ 100 nm e é composto por um feixe de protofilamentos FtsZ solto que se sobrepõem uns aos outros, em três dimensões. Estes dados fornecem um trampolim para outras investigações das alterações do ciclo celular dependentes da ¹⁰ Z-anel e pode ser aplicado a outras proteínas de interesse.

Protocol

1. Preparação da Amostra Inocular meio LB com uma única colónia da estirpe JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Crescer durante a noite num agitador a 37 ° C. Dilui-se a cultura de 1:1000 em meio mínimo M9 + [sais M9, 0,4% de glucose, 2 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl 2, ácidos aminados e vitaminas MEM] e crescer a mid-log de ​​fase (OD 600 = 0,2-0,3) na presença de cloranfenicol (150 ug / ml) à temperatura ambiente (RT). …

Representative Results

Ilustrado na Figura 3Aiv é um bi-dimensional, render super-resolução do anel Z-gerado a partir do método de imagem PALM descrito acima. Abaixo, resumem-se informação qualitativa e quantitativa que pode ser obtido a partir deles. Qualitativamente, observamos que o Z-anel é uma estrutura irregular que adota várias configurações (única banda ou arco helicoidal) que não são distinguíveis em imagens convencionais de fluorescência (Figura 3A comparar-Dii</st…

Discussion

Imagens PALM contêm informações sobre as contagens de moléculas e posições dentro de uma célula, permitindo uma análise detalhada da distribuição e arranjo de moléculas de proteína alvo que é difícil de conseguir por outros meios. Abaixo destacamos as precauções que devem ser tomadas para extrair informações quantitativas precisas, mantendo a relevância biológica de imagens de palma. Nós também explorar a informação que pode ser melhor obtidos utilizando células vivas vs fixo. Por fim, sugerimos…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
50 x MEM Amino Acids	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamins	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyde	Electron Micrsocopy Sciences	15710-S
SeaPlaque GTG Agarose	Lonzo	50111
50 nm Gold Beads	Microspheres-Nanospheres	790113-010
FCS2 Imaging Chamber	Bioptechs
Stage Adaptor	ASI	I-3017
Inverted Microscope	Olympus	IX71
1.45 NA, 60x Objective	Olympus
IXON EMCCD Camera	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire Laser	Coherent
561-nm Sapphire Laser	Coherent
405-nm CUBE Laser	Coherent