Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung
Summary
Wir messen die Spannung zu lösen in einem Axon, die teilweise mit einem Laser dissector durch gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messung an einem optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons durchgeführt wurde lädierten. Das entwickelte Versuchsprotokoll wertet das Axon Haftung auf dem Kultursubstrat.
Abstract
Die Bildung von funktionalen Zusammenhänge in einem Entwicklungsland neuronale Netzwerk wird durch extrinsische Cues beeinflusst. Das Neuritenwachstum von sich entwickelnden Neuronen unterliegt chemische und mechanische Signale, und die Mechanismen, durch die er spürt und reagiert auf mechanische Signale werden kaum verstanden. Die Aufklärung der Rolle der Streitkräfte in Zell-Reifung wird das Design von Gerüsten, die Zelladhäsion und Zytoskelett-Kopplung mit dem Substrat zu fördern und damit die Verbesserung der Fähigkeit der verschiedenen neuronalen Typen nach einer Verletzung regenerieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, um die gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messungen während der Laser-induzierten Zell-Läsion gelten. Wir messen Spannung Release in der teilweise lädierten Axon durch gleichzeitige interferometrischen Tracking eines optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons. Unsere experimentellen Protokoll erkennt die Spannung Release mit Pikonewton Empfindlichkeit und die Dynamik der Spannung Freisetzung beiMillisekunden-Auflösung. Somit ist es ein hochauflösendes Verfahren zu untersuchen, wie die mechanischen Verbindungen zwischen den Zellen und Substrate moduliert werden kann durch medikamentöse Behandlung und / oder durch unterschiedliche mechanische Eigenschaften des Substrats.
Introduction
Optische Mikroskopie ist eine der weniger invasiven bildgebenden System zur Verfügung zu lebenden Zellen zu beobachten. Mit der Nutzung von Effekten wie Strahlungsdruck (wie in einer optischen Pinzette 1) oder hochenergetischen Photonen-Flux (wie im Laser dissector 2) wurde diese Technologie, um Nano-Manipulation erweitert. Die optische Imaging-System liefert eine präzise Steuerung zu visualisieren und zu manipulieren sub zellulären Targets 3. Zur gleichen Zeit, dank der präzisen Kalibrierung des gelieferten Laserleistung, erreichen optischen Werkzeuge entweder weich oder invasive Probenmanipulation mit beispielloser Reproduzierbarkeit.
Mehrere Labors integriert, in derselben Versuchsanordnung, optische Pinzetten und Laser Dissektor um Organellen 4, miteinander zu verschmelzen verschiedenen Zellen 5 oder Zellen durch optisch angetrieben Ladungen 6,7 stimulieren abzutragen. Während optische Pinzette, nach der Kalibrierung des optischen Steifigkeit, für erlaubendie Kontrolle der aufgebrachten Kraft auf die Zelle auf einer Skala Pikonewton können Laser Dissektion Systeme modulieren optische Manipulation, die von Membran Foto-ration der Ablation einzelner Organellen oder Dissektion der sub-zellulären Strukturen reicht. Jedoch beruht Laser Dissektion Kalibrierung auf qualitative Beurteilung der Einheit von optischen Manipulation in Bezug auf die Energie, die an die Probe, vor allem auf Bildanalyse veranschaulicht morphologischen Veränderungen verursacht, die dem Muster 8 basiert. In dem vorgestellten Verfahren zeigen wir, wie man Kraft-Spektroskopie Messung während des Laser axonal Dissektion einer sich entwickelnden Neuronen führen, zu quantifizieren, auf Pikonewton Skala, die Kraft durch eine veränderte Gleichgewicht im Zytoskelett-Struktur eines sub-zellulären Fach 9 produziert. Kultivierten Neuronen an dem Substrat haften, und während der Entwicklung zu polarisieren. Die Polarisation Phase tritt während der ersten fünf Tage in vitro. In Stufe zwei der Polarisierung, einer der Extrudering Neuriten länger wird, und es wird zu differenzieren, um das Axon 10 geworden. Axonal Dehnung in Reaktion auf Zugkraft am Wachstum Kegel wurde zuvor von Dennerl-Modell 11 modelliert. Vor kurzem ist dieses Modell 12 verlängert, um die Rolle von Neuriten Adhäsion an die extrazelluläre Matrix Substrate umfassen. Diese biophysikalische Modell nach experimentellen Beobachtungen 13 vorgeschlagen, zeigten, dass Zugkräfte auf das Wachstum Kegel, der sich entlang der Neuriten, moduliert von fokalen Adhäsionen zu dem Substrat. Ebenso produziert axonale Läsion eine lokale Freisetzung von Spannungen hin ausbreiten Zellkörper. So haben wir vorgeschlagen, dass die Messung solcher freigegeben Spannung an einem Ort entlang des Axons zwischen der Verletzung und der Zelle soma bietet die Möglichkeit, die dämpfende Ergebnis unberührt fokalen Adhäsionen zu bewerten.
Wir kalibrieren die notwendige Energie Photon-Fluss des Lasers Dissektor, um das Ausmaß des zugefügten axonalen damag steuerne, von der kompletten Durchtrennung einer partiellen Läsion. Nach der Kalibrierung, wiederholten wir partielle Läsion der Axone von mehreren differenzierenden Neuronen und entwickelte das Protokoll, um die Spannung zu lösen quantifizieren und somit erhalten eine quantitative Parameter, um die Haftung der Axon auf das Substrat 14 zu schätzen.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir im Detail die entwickelte Protokoll, das eine genaue experimentelle Verfahren zu ermitteln und zu vergleichen mit Pikonewton Empfindlichkeit des axonalen Haftung auf dem Substrat in verschiedenen experimentellen Bedingungen wie chemische Behandlung 14, oder verschiedene Arten von Zellkultur Unterstützung darstellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir berichten in dieser Arbeit eine quantitative Methode, um die Neuriten Haftung auf dem Substrat Kultur vergleichen, indem Sie gleichzeitig Kraft-Spektroskopie Messung während laserinduzierten Zelle Läsion. Die gemessene Freisetzung von Spannung auf den Grad der Haftung der Zellen an das Substrat bezogen werden: Zellen mit einer höheren Anzahl von fokalen Adhäsionen zu weniger Verspannungen. Die Messung der Freisetzung von Spannungen in Bezug auf Pikonewton bietet eine physikalische Größe, durch die die axonale …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberto Guiggiani für die Entwicklung des Echtzeit-Steuersystem, Evelina Chieregatti und Hanako Tsushima für aufschlussreiche Diskussionen, Giacomo Pruzzo und Alessandro Parodi für die Entwicklung von kundenspezifischen Elektronik und Software, und Claudia Chiabrera und Marina Nanni für ihre kompetente Beratung und Unterstützung in der Zellkultur Vorbereitung.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
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