Lazer Bağlı Akson Lezyon sırasında Gerilim Film ölçümü Piconewton ve Milisaniye Çözünürlük de Yüzey için aksonal yapışma değerlendir
Summary
Biz kısmen akson zarı yapışık bir optik-tuzak prob yapılan eş zamanlı kuvvet spektroskopisi ölçümü ile bir lazer disektör ile lezyonlanmıştır olan bir akson gerginlik serbest ölçtük. Geliştirilen Deneysel protokol, kültür alt tabakaya yapışma akson değerlendirir.
Abstract
Gelişmekte olan bir nöronal ağ işlevsel bağlantı oluşumu dışsal kuyrukları tarafından etkilenir. Gelişmekte olan nöronların neurite büyüme kimyasal ve mekanik sinyalleri tabidir ve mekanizmaları hangi mekanik sinyallere algıladığında ve cevap tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre olgunlaşmasında güçlerin rolü nedenlerine açıklık yüzeye hücre yapışması ve iskelet bağlantı teşvik iskelelerinin tasarım sağlamak ve bu nedenle yaralanma sonrası yeniden oluşturmak için farklı nöronal türleri kapasitesini artıracaktır.
Burada, lazer kaynaklı hücre lezyon sırasında aynı anda yürürlüğe spektroskopi ölçümleri uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz akson zarı yapışık bir optik tuzak prob aynı anda İnterferometrik izleme tarafından kısmen lezyonlu akson gerginlik serbest ölçün. Bizim deneysel protokol piconewton hassasiyetle gerginlik serbest algılar, ve de gerginlik sürümü dinamikmilisaniye zaman çözünürlüğü. Bu nedenle, bu hücreler ve alt tabakalar arasında, mekanik bağlantı farmakolojik tedavisi ve / ya da ayrı bir alt-tabakanın mekanik özellikleri ile modüle edilebilir nasıl çalışma için yüksek çözünürlüklü bir yöntem sunmaktadır.
Introduction
Optik mikroskop canlı hücrelerin gözlemlemek için kullanılabilir daha az invazif görüntüleme sistemi biridir. Bu radyasyon basıncı (optik cımbız 1 gibi), ya da yüksek enerjili foton akı (lazer ayrıştırıcısındaki 2 gibi) gibi etkileri sömürü ile, bu teknoloji nano-manipülasyon şekilde genişletildi. Optik görüntüleme sistemi 3 görselleştirmek ve alt hücresel hedefleri işlemek için bir hassas kontrol vermektedir. Aynı zamanda, teslim lazer gücünün doğru kalibrasyon sayesinde, optik araçlar görülmemiş tekrarlanabilirlik ile ya yumuşak veya invaziv örnek manipülasyon gerçekleştirmek.
Çeşitli laboratuarlar farklı hücreler 5 araya kaynaştırmak için, ya da optik tahrik kargolar 6,7 ile hücreleri uyarmak için organeller 4, baskılamak için aynı deney düzeneği, optik cımbız ve lazer ayrıştırıcısındaki, entegre. Optik cımbız, optik sertlik kalibrasyon sonra, izin süreBir piconewton ölçekte hücreye uygulanan kuvvetin kontrolü, lazer diseksiyon sistemleri membran fotoğraf poration gelen alt hücresel yapılar tek organel veya diseksiyon ablasyonu arasında değişmektedir optik manipülasyon, modüle olabilir. Ancak, lazer diseksiyon kalibrasyon ağırlıklı olarak örnek 8 neden morfolojik değişiklikler gösteren görüntü analizi dayalı örnek teslim enerji, göre optik manipülasyon işletmenin nitel değerlendirme gerektirir. Sunulan yöntemde, biz piconewton ölçekte, ölçmek için, gelişmekte olan bir nöronun lazer aksonal diseksiyonu sırasında kuvvet spektroskopisi ölçüm gerçekleştirmek için nasıl göstermek, bir alt hücresel bölmesi 9 hücre iskeleti yapısında bir değişmiş denge ile üretilen güç. Kültür nöronlar yüzeye bağlı ve gelişimi sırasında polarize. Polarizasyon faz in vitro ilk beş gün içinde ortaya çıkar. Aşamada polarizasyon iki ekstrüzyon preslerinin birineing neurites daha uzun olur ve bu akson 10 olmak ayırt edecektir. Büyüme konisi de çekme kuvveti yanıt olarak aksonal uzama daha önce Dennerl modeli 11 ile modellenmiştir. Son zamanlarda, bu model hücre dışı matriks yüzeylere nörit yapışma rolünü içerecek şekilde 12 genişletilmiştir. Deneysel gözlemler 13 sonra önerilen Bu biyofiziksel modeli,,, nörit boyunca yayılan, büyüme konisi üzerinde kuvvetleri çekerek yüzeye odak yapışıklıklar modüle olduğunu göstermiştir. Aynı şekilde, aksonal lezyon hücre gövdesi doğru yayılan gerilim yerel bir sürümü üretir. Böylece, lezyon ve hücre soma arasındaki akson boyunca bir yerde bu tür serbest gerilim ölçme etkilenmemiş odak yapışıklıklar nemlendirme sonucu değerlendirmek için imkan sunuyor önerdi.
Biz açtığı aksonal damag ölçüde kontrol etmek için gerekli olan enerji lazer ayrıştırıcısındaki foton akısı-kalibree, tam transeksiyonu kısmi lezyona. Kalibrasyon takiben, bir çok ayırt nöronun akson kısmi lezyon tekrarlandı ve gerilim serbest ölçmek için protokol geliştirilmiş ve böylece alt tabaka 14 için akson yapışma tahmin etmek için bir sayısal parametre elde edilmiştir.
Bu çalışmada, ayrıntılı olarak, kimyasal muamele 14 ya da hücre kültürü destek farklı tipleri gibi farklı deney koşullarında substrata yapışma aksonal değerlendirmek ve piconewton duyarlılığı ile karşılaştırmak için kesin bir deney prosedürü gösteren geliştirilmiş protokolünü açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz bu çalışmada lazer kaynaklı hücre lezyon sırasında aynı anda kuvvet spektroskopisi ölçüm yaparak, kültür yüzeye neurite yapışma karşılaştırmak için kantitatif bir yöntem rapor. Gerilim Ölçülen serbest yüzeye hücrenin yapışma derecesi ile ilgilidir: odak yapışıklıklar daha yüksek bir sayı ile hücrelerin daha az gerilim serbest olmalıdır. Piconewtons açısından gerilim salınımını Ölçüm farklı deneysel koşullar 14 kültür destek aksonal yapışma değerlendir…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gerçek zamanlı kontrol sistemi, anlayışlı tartışmalar, Giacomo Pruzzo ve Alessandro Parodi özel elektronik ve yazılım geliştirme için, ve Claudia Chiabrera ve uzman tavsiyesi ve hücre kültürü hazırlanmasında yardım için Marina Nanni için Evelina Chieregatti ve Hanako Tsushima geliştirmek için Alberto Guiggiani.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
Referencias
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
