מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה
Summary
מדדנו את שחרור המתח באקסון שlesioned באופן חלקי עם מבתר לייזר על ידי מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית מבוצעת על בדיקה אופטית-לכודה דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי פיתחה מעריך את האקסון ההידבקות למצע התרבות.
Abstract
היווצרות של קשרים פונקציונליים עצבית ברשת פיתוח מושפעת על ידי רמזים חיצוניים. צמיחת neurite של נוירונים מתפתחים כפופה לאותות כימיים ומכאניים, והמנגנונים שבאמצעותם הוא חש ומגיב לאותות מכאניים הם הבינו היטב. הבהרת תפקידם של כוחות בהתבגרות תא תאפשר את העיצוב של פיגומים שיכולים לקדם את הידבקות תא וצימוד cytoskeletal למצע, ולכן לשפר את היכולת של סוגים שונים עצביים להתחדש לאחר פציעה.
כאן, אנו מתארים שיטה ליישם מדידות ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית בנגע תא מושרה לייזר. אנו מודדים את שחרור מתח באקסון באופן חלקי על ידי מעקב lesioned interferometric סימולטני של חללית לכודה אופטי דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי שלנו מזהה את שחרור המתח עם רגישות piconewton, והדינמיקה של שחרור המתח ברזולוציה זמן אלפית השנייה. לכן, היא מציעה שיטת רזולוציה גבוהה ללמוד איך הצימוד מכאני בין תאים ומצעים יכול להיות מווסת על ידי טיפול תרופתי ו / או על ידי תכונות מכאניות שונות של המצע.
Introduction
מיקרוסקופיה אופטית היא אחד ממערכת ההדמיה פחות פולשנית זמינה להתבונן תאי חיים. עם הניצול של תופעות כגון לחץ קרינה (כמו בפינצטה האופטית 1), או שטף פוטונים באנרגיה גבוהה (כמו בליזר המבתר 2), טכנולוגיה זו הוארכה עד ננו מניפולציה. מערכת ההדמיה האופטית מספקת שליטה מדויקת לדמיין ולתפעל מטרות הסלולר משנה 3. באותו הזמן, הודות לכיול מדויק של כוח לייזר נמסר, כלים אופטיים להשיג או מניפולציה מדגם רכה או פולשני עם שחזור חסר תקדים.
מספר מעבדות משולבות, באותה הגדרת ניסוי, פינצטה אופטית וליזר מבתר כדי לקטוע האברונים 4, לפתיל יחד 5 תאים שונים, או כדי לעורר את התאים על ידי מטענים מונעים אופטי 6,7. בעוד פינצטה אופטית, לאחר כיול של הקשיחות האופטית, תאפשרהשליטה הפעיל כוח לתא בקנה מידת piconewton, מערכות לייזר לנתיחה יכולה לווסת את המניפולציה אופטית, שנעה בין קרום צילום poration לאבלציה של אברונים או נתיחה בודדות של מבנים תת סלולריים. עם זאת, כיול נתיחת לייזר מסתמך על הערכה איכותית של הישות של מניפולציה אופטית ביחס לאנרגיה שנמסרה למדגם, המבוססת בעיקר על ניתוח תמונה הממחיש את השינויים מורפולוגיים שנגרמו לדגימת 8. בשיטה שהוצגה, אנו מדגימים כיצד לבצע מדידת ספקטרוסקופיה תוקף במהלך נתיחת axonal לייזר של נוירון פיתוח, לכמת, בקנה מידת piconewton, הכח הנוצר על ידי שיווי משקל משתנה במבנה שלד התא של תא משנה הסלולר 9. נוירונים בתרבית לדבוק במצע, ולקטב במהלך פיתוח. שלב הקיטוב מתרחש במהלך חמשת הימים הראשונים במבחנה. בשלב שתיים של קיטוב, אחד extrudneurites ing הופך ארוך יותר, וזה יהיה להבדיל להפוך האקסון 10. התארכות axonal בתגובה לכוח הגרירה בחרוט הצמיחה כבר דגם בעבר על ידי המודל של Dennerl 11. לאחרונה, מודל זה הורחב כדי לכלול 12 את התפקיד של הידבקות neurite למצעי מטריקס. מודל biophysical זו, מוצע לאחר תצפיות ניסיוניות 13, הראה כי משיכת כוחות על חרוט צמיחה, מתפשטת לאורך neurite, הם מווסת על ידי הידבקויות מוקד למצע. כמו כן, נגע axonal מייצר שחרור מקומי של מתח מתפשט לכיוון גוף התא. לפיכך, אנו מציעים כי מדידת מתח שוחרר כזו במיקום לאורך האקסון בין הנגע וסומה התא מציעה את האפשרות להעריך את סיכויי הריסון של הידבקויות מוקד שלא נפגעו.
אנו מכיילים את האנרגיה הדרושה פוטון-השטף של מבתר לייזר כדי לשלוט על היקף damag axonal נגרמהדואר, מחיתוך רוחב מלא לנגע חלקי. בעקבות הכיול, אנחנו חזרתי באופן חלקי לנגע את האקסונים של תאי עצב כמה מבדילים ופיתח את הפרוטוקול לכמת את שחרור המתח, וקיבל פרמטר הכמותי לאמוד את ההידבקות של האקסון למצע ובכך 14.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול פיתחה, המייצג את הליך ניסוי מדויק כדי להעריך ולהשוות עם רגישות piconewton הידבקות axonal למצע בתנאים שונים ניסיוניים כגון טיפול כימי 14, או סוגים שונים של תמיכת תרבית תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מדווחים בעבודה זו שיטה כמותית להשוואת הידבקות neurite למצע התרבות, על ידי ביצוע מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית בנגע תא מושרה לייזר. שחרורו נמדד מתח קשור למידת ההדבקה של התא למצע: תאים עם מספר גבוה יותר של הידבקויות מוקד צריכים לשחרר פחות מתח. מדידת שחרור המתח במונחי?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אלברטו Guiggiani לפיתוח מערכת הבקרה בזמן אמת, אוולינה Chieregatti וHanako צושימה לדיוני תובנה, ג'אקומו Pruzzo ואלסנדרו פארודי לפיתוח אלקטרוניקה ותוכנה מותאמות אישית, וקלאודיה Chiabrera ומרינת נאני לייעוץ המקצועי שלהם וסיוע בהכנת תרבית תאים.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
Referencias
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
