Измерение Ослабление натяжения в процессе лазерного поражения Индуцированные Axon для оценки аксонов адгезию к основанию и Piconewton в миллисекундах
Summary
Мы измеряли напряжение выпуска в аксон, который был частично поврежденных с помощью лазера рассекатель одновременное измерение силовой спектроскопии проводили на оптически-ловушки зонд приклеен к мембране аксона. Разработанный экспериментальный протокол оценивает аксон адгезию к культуральной подложки.
Abstract
Формирование функциональных соединений в разработке нейронной сети зависит от внешних сигналов. Нейрита роста развивающихся нейронов подлежит химической и механической сигналов и механизмы, с помощью которых он чувствует и реагирует на механические сигналы плохо изучены. Выяснения роли силы в камере созревания позволит конструкции каркасов, которые могут способствовать клеточной адгезии и цитоскелета связи с подложкой, и, следовательно, улучшить способность различных типов нейронов к регенерации после травмы.
Здесь мы опишем метод применять одновременные измерения силовой спектроскопии при лазерном клетки, вызванное поражением. Мы измеряем снимающее напряжение в частично поврежденных аксонов одновременным интерферометрическом отслеживания оптической ловушке зонда придерживался мембране аксона. Наш экспериментальный протокол определяет снимающее напряжение с чувствительностью piconewton и динамика ослабления натяжения намиллисекунду временным разрешением. Поэтому оно предлагает высокое разрешение способ изучить, как механическая связь между клетками и субстраты могут быть модулированы по фармакологическому лечению и / или различные механические свойства подложки.
Introduction
Оптическая микроскопия является одним из менее инвазивных система визуализации доступны для наблюдения живых клеток. С эксплуатацией эффекты, такие как давление излучения (как в оптических пинцетов 1), или высокой энергии потока фотонов (как в лазерных диссекторе 2), эта технология была распространена на нано-манипуляции. Оптической системы дает точного контроля для визуализации и управления суб клеточных мишеней 3. В то же время, благодаря точной калибровки поставляемых мощности лазера и оптических инструментов достижения мягкой или инвазивные манипуляции образца с беспрецедентной воспроизводимости.
Несколько лабораторий интегрированы в той же экспериментальной установке, оптических пинцетов и лазерной рассекатель для того, чтобы удалять органелл 4, соединить вместе различные ячейки 5, или стимулировать клетки оптически приводом грузов 6,7. В то время как оптический пинцет, после калибровки оптического жесткость, позволяютконтроль приложенной силы к ячейке по шкале piconewton, лазерных систем вскрытия может модулировать оптическое манипулирование, которое колеблется от мембраны фото-порации абляции одной органеллы или рассечение субклеточных структур. Однако, лазерное рассечение калибровки опирается на качественную оценку субъекта оптическое манипулирование по отношению к энергии, подводимой к образцу, в основном на основе анализа изображений иллюстрирующие морфологические изменения, вызванные к образцу 8. В предложенном методе, мы покажем, как выполнить силовой спектроскопии измерения в течение лазерного рассечения аксональное развивающихся нейронов, в количественном выражении, по шкале piconewton, сила, создаваемая измененное равновесие в структуре цитоскелета субклеточном камеры 9. Искусственный нейронов прилипать к подложке, и поляризации в процессе разработки. Поляризации фазы происходит в течение первых пяти дней в пробирке. На втором этапе поляризации, одна из extrudния нейритов становится больше, и она будет дифференцироваться, чтобы стать аксона 10. Удлинение аксонов в ответ на силу буксировки на конус роста ранее моделируется модель Dennerl 11. В последнее время эта модель была расширена, чтобы включить 12 роль нейритов адгезию к внеклеточной матричных субстратов. Это биофизические модели, предложен после экспериментальных наблюдений 13, показал, что тяговое усилие на конус роста, распространяющихся вдоль аксонов, которые модулируются фокальные адгезии к подложке. Кроме того, поражение аксональное производит местный снятие напряжения, продвигаясь к телу клетки. Таким образом, мы предположили, что такие измерения напряженности выпустили в месте, вдоль аксона между поражением и клетка сома дает возможность оценить увлажняющего результат влияет фокальные адгезии.
Мы калибровку необходимой энергией фотонов потока лазерного диссекторе контролировать степень нанесенного аксональное повреждающихе, от полной перерезки частичного поражения. После калибровки, мы повторили частичного поражения в аксонах несколько дифференциации нейронов и разработали протокол для количественной оценки напряжения выпуска, и полученные таким образом количественный параметр для оценки адгезии аксон к подложке 14.
В настоящей работе мы подробно разработанный протокол, который представляет собой точную экспериментальную методику для оценки и сравнения с чувствительностью piconewton аксонов адгезию к подложке в различных экспериментальных условиях, таких как химическая обработка 14, или различные типы клеточных поддержки культуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы сообщаем в этой работе количественные методы для сравнения нейрита адгезией к подложке культуры, при проведении одновременных измерений силовой спектроскопии при лазерном клетки, вызванное поражением. Измеренные снятие напряжения связан со степенью адгезии клетка с подложкой: кл…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Альберто Guiggiani для развития реального времени система управления, Эвелина Chieregatti и Ханако Цусима для обсуждений проницательный, Джакомо Pruzzo и Алессандро Пароди для разработки пользовательских электроники и программного обеспечения, и Клавдия Chiabrera и Марина Нанни за их экспертные консультации и помощь в подготовке ячейки культуры.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
Referencias
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
