داخل عضلة القلب توصيل الخليوي: ملاحظات في قلوب الفئران
Summary
تسليم خلية داخل عضلة القلب في نماذج الفئران من أمراض القلب والأوعية الدموية، مثل ارتفاع ضغط الدم أو احتشاء عضلة القلب، ويستخدم على نطاق واسع لاختبار الإمكانات العلاجية من أنواع مختلفة من الخلايا في الدراسات التجدد. ولذلك، فإن وصفا مفصلا وتصورا واضحا لهذا الإجراء الجراحي يساعد على تحديد حدود ومزايا خلية التحليلات العلاجية القلب والأوعية الدموية في القوارض الصغيرة.
Abstract
وأظهرت دراسات سابقة أن تسليم خلية يعزز تحسين وظيفة القلب عن طريق الإفراج عن السيتوكينات والعوامل التي تزيد من عودة التوعي أنسجة القلب وبقاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك، كشفت المزيد من الملاحظات أن الخلايا الجذعية محددة، مثل الخلايا الجذعية القلبية، الخلايا الجذعية الوسيطة وcardiospheres لديهم القدرة على الاندماج داخل عضلة القلب المحيطة عن طريق التفريق في العضلية، خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية.
هنا، نقدم المواد والأساليب لتقديم موثوق الخلايا noncontractile في جدار البطين الأيسر من الفئران immunodepleted. الخطوات البارزة لهذا الإجراء المجهرية تشمل التخدير وحقن تسكين، داخل الرغامى التنبيب، شق لفتح الصدر وكشف القلب والتسليم من الخلايا العقيمة عيار 30 إبرة وحقنة الدقة ميكروليتر.
معالجة الأنسجة التي تتكون من حصاد القلب، embeddiنانوغرام، باجتزاء وأظهرت تلطيخ النسيجية أن حقن الخلايا داخل عضلة القلب أنتج الضرر صغيرة في منطقة النخابية، وكذلك في جدار البطين. تم الإبقاء على الخلايا Noncontractile في جدار عضلة القلب لدى الفئران المناعة وكانت محاطة بطبقة من الأنسجة متليفة، من المحتمل للحماية من الضغط القلب وتحميل الميكانيكية.
Introduction
وقد تم اختبار مختلف البروتوكولات تسليم خلية في الفئران والجرذان نماذج من أمراض القلب والشرايين وذلك بهدف ترجمة كفاءة وفعالية وسلامة هذا الإجراء التجريبي في المرضى من البشر. في قلوب القوارض الصغيرة، والتسليم خلية داخل عضلة القلب هو الأسلوب الأكثر جدوى من تسليم خلية 1،2، في حين أنه في تقدمي الفئران القلب 3 و 4 إلى الوراء خلية داخل التاجي التسريب يمكن أن تستخدم أيضا. كلتا الطريقتين لها حدود ومزايا. تسليم الخليوي عبر الطريق داخل التاجي مزاياه النظرية على الحقن العضلي المباشر في تعزيز نشر خلية العالمية 3، ولكن كما أن لديها خطر التسبب في انسداد الشريان التاجي 3،5. وترتبط القيود على تسليم داخل عضلة القلب مع اصابة الميكانيكية، والتهاب حاد، وعضلة القلب الضرر 6،7. في البشر، يتم تسليم خلايا لإصلاح القلب عن طريق الحقن داخل عضلة القلب من خلال النخابية الشغاف أو الجراحيالاقتراب أو الطريق الشرياني داخل التاجي 8. هي مناسبة حقن عبر طرق transvascular في المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب الحاد وإشباعها، ولكن قد لا يكون ممكنا في حالة انسداد أو مجموع ضعف تدفق داخل الأوعية من أراضي تنفذ 9. الحقن المباشر في جدار البطين عن طريق الحقن أو transendocardial transepicardial مجدية تقنيا تبعا لحالة المريض الصحية. في الواقع، وقد تبين أن هذه التقنية آمنة 10،11، على الرغم من حقن transepicardial عملية جراحية مفتوحة الصدر ضروري وللtransendocardial نهج مخطط الكهربية لكل مريض مطلوب للتمييز مواقع قابلة للحياة الدماغية أو شوه عضلة القلب 9.
الأهم من ذلك، في الدراسات العلاج بالخلايا اختيار أفضل الخلية المراد زرعها لا يزال قيد التحقيق. وأظهرت التحليلات على المدى القصير (4 أسابيع) أن حقن الخلايا الجذعية في القلب يعرف بأنه cardiospheres <sتصل> 12 أو الخلايا السكان الجانب من نخاع العظام التي يسببها 13 الانتعاش وظيفية القلب في الفئران والجرذ 14 15 احتشاء عضلة القلب نماذج من خلال خفض حجم ندبة وموت الخلايا. تم العثور على زرع خيفي من cardiospheres في الفئران نموذج احتشاء عضلة القلب دون كبت المناعة لتكون آمنة، وروجت تجديد القلب، وتحسين وظيفة القلب من خلال تحفيز آليات إصلاح الذاتية 15. عرضت Lin-/c-kit + الكبار الخلايا الاصلية في القلب ليكون تجديد الذات، مولد الرمع، ومتعددة القدرات في المختبر والمجراة، وعند حقنه في قلب الفئران الدماغية المعاد أجزاء كبيرة من الجدار عضلة القلب المصاب 16 وكان القدرة على تكوين موصل والمتوسطة الحجم الشرايين التاجية 17. المرحلة غذت هذه البيانات واعدة الأول والثانية من التجارب السريرية في البشر: حقن الخلايا الجذعية الوسيطة ذاتي وخيفي (MSC) 18، 19 cardiospheres20 في كل قلوب البشر الدماغية أظهرت، أو ج كيت الخلايا الجذعية القلبية الإيجابية (CSC) الآثار المفيدة في وظيفة القلب في دراسات على المدى الطويل. ومع ذلك، واسعة المدى الطويل المتابعة وبأثر رجعي التحليل التلوي أثبتت أن العلاج بالخلايا الجذعية يوفر فوائد كبيرة لبعض المرضى، ولكن ليس في الآخرين مع مجموعة من نتائج لا يمكن التنبؤ بها 21. فمن الممكن أن هذه القيود سوف يستلزم تصميم بروتوكولات محددة لتسليم خلية لكل فرد ولكل مرض.
في الماوس والفئران نماذج، كشفت دراسات طويلة الأجل التي حقن الخلايا لم مواصلة تحسين وظيفة القلب (12 شهرا). في الواقع، تم عزل ترقيع الخلايا العضلية الجنينية الجذعية البشرية المستمدة من الخلايا (HESC-CM) إلى حد كبير من عضلة القلب المضيف طبقة من الأنسجة متليفة 22،23. وقد لوحظت نتائج مماثلة بعد زرع داخل عضلة القلب والهيكل العظمي من myoblasts في قلب الفئران احتشاء 24. Furthermoإعادة، والقدرة على المدى الطويل من اللجان الدائمة خيفي للحفاظ على وظيفة في قلب احتشاء كان محدودا بسبب الانتقال من immunoprivileged إلى حالة مناعة بعد التمايز 25.
مع الأخذ بعين الاعتبار التحديات والآفاق المذكورة أعلاه، وتبين لنا هنا كيفية إيصال الخلايا عن طريق الحقن داخل عضلة القلب في الفئران. نلاحظ أن الخلايا دون cardiomyocyte خصائص مقلص لا ترتبط عضلة القلب المضيف وتشكل كتلة متماسكة مع حاجز متليفة رقيقة. على الرغم من أن في بعض الحالات هذه النتيجة قد يكون من المفيد، قد يكون التحليل التالي المفيد أن نفهم كيف يمكن التضمين engraftment الخلايا لتوليد هياكل عضلة القلب متصلة وظيفيا كذلك.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا المخطوط، لقد أظهرنا كيفية إجراء الحقن داخل عضلة القلب من الخلايا في قلوب الفئران. كدليل على هذه المنهجية، وقد استخدمنا HEK293 الخلايا. من المهم التأكيد على أن خلايا HEK293 لا تستخدم في أي دراسة العلاج بالخلايا وبالتالي فإن نتائج هذه المخطوطة ليست مناسبة لترجمة مباش?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر معهد مجدي يعقوب (MYI) لدعم التحليل المجهري والمشاريع التي تنطوي على إصلاح القلب، وفنيي ومدير منشأة الحيوانية لدينا. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة القلب البريطانية (فتقول)، ومنحة مشروع PG/10/019. ويدعم MPS من قبل MYI وفتقول. TP هو التميز زميل فتقول البحوث. NR هو NH & MRC أستراليا زميل.
Materials
| Isolator | Pfi systems | – | Quotation needed |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| medetomidine | National veterinary Service | – | Veterinary prescription is necessary |
| ketamine hydrochloride | National veterinary Service | – | Veterinary prescription is necessary |
| atipamezole | National veterinary Service | – | Veterinary prescription is necessary |
| Hair removal cream | Commercial shops | – | |
| buprenorphine | NVS | – | Veterinary prescription is necessary |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200grams |
| 30G 12mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700 |
| 6-0 silk suture | Ethicon | W1614T |
Referencias
- Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
- Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
- Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
- Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
- Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
- Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
- Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
- Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
- Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
- Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. , 125-1100 (2012).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
- Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
- Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine – future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
- Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
- Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
- Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
- Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
- Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
- Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
- van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
- Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
- Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
- Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats.. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
- Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
- Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
- Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
- Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
- Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
- Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
- Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).
