Intramyocardiale Cell Levering: Waarnemingen in Muizen Harten

Summary

Intramyocardial cel levering in muriene modellen van cardiovasculaire ziekten, zoals hypertensie of myocardiaal infarct, wordt veel gebruikt om het therapeutisch potentieel van verschillende celtypes in regeneratieve studies testen. Daarom zal een gedetailleerde beschrijving en een duidelijke visualisatie van deze chirurgische procedure helpen om de beperkingen en voordelen van cardiovasculaire cel therapeutische analyses in kleine knaagdieren te definiëren.

Abstract

Eerdere studies toonden aan dat de cel levering bevordert de hartfunctie verbetering door afgifte van cytokinen en factoren die hartweefsel revascularisatie en overleving van cellen te verhogen. Bovendien aanvullende opmerkingen bleek dat stamcellen, zoals hart stamcellen, mesenchymale stamcellen en cardiospheres hebben de mogelijkheid om te integreren in het omliggende myocard door differentiëren in cardiomyocyten, gladde spiercellen en endotheelcellen.

Hier presenteren we de materialen en methoden betrouwbare levering noncontractile cellen in de linker ventriculaire wand van immunologisch muizen. De meest opvallende stappen van deze microchirurgische procedure te betrekken anesthesie en analgesie injectie, intratracheale intubatie, incisie aan de borst te openen en het hart en de levering van de cellen bloot door een steriele 30-gauge naald en een precisie microliter spuit.

Weefselverwerking bestaande uit hart oogsten, embedding snijden en histologische kleuring toonde aan dat intramyocardial celinjectie produceerde een kleine beschadiging het epicardiale gebied, en in de ventriculaire wand. Noncontractile cellen werden gehandhaafd in de myocardiale wand van immuungecompromitteerde muizen en werden omringd door een laag van fibrotisch weefsel, waarschijnlijk tegen cardiale druk en mechanische belasting.

Introduction

Verschillende cel leveringsprotocollen zijn getest in muizen en ratten modellen van cardiovasculaire ziekten teneinde vertalen de efficiëntie, doeltreffendheid en veiligheid van deze experimentele procedure menselijke patiënten. In kleine knaagdier harten, intramyocardiale cel levering is de meest haalbare methode van cel levering ^1,2, terwijl in de rat hart antegrade ³ es ⁴ retrograde intracoronaire cel infusie kan ook worden gebruikt. Beide methoden hebben beperkingen en voordelen. Cel levering intracoronair heeft theoretische voordelen ten opzichte van directe intramusculaire injectie in de bevordering van de wereldwijde verspreiding cel ^3, maar het heeft ook het risico van het veroorzaken van coronaire embolie ^3,5. Beperkingen op intramyocardiale levering worden geassocieerd met mechanische schade, acute ontsteking, en myocardschade ^6,7. Bij de mens, zijn cellen voor cardiale reparatie door intramyocardiale injectie geleverd via een endocardiale of chirurgische epicardiaalbenaderen of door intracoronair arteriële route ^8. Injectie door transvasculaire routes is geschikt bij patiënten met acute infarct en gereperfundeerde myocard, maar is niet altijd mogelijk in het geval van totale afsluitingen of slechte doorstroming binnen de vaten van de getroffen gebied ^9. Directe injectie in de ventriculaire wand van transendocardial of transepicardial injectie technisch mogelijk afhankelijk van de patiënt gezondheidstoestand. Inderdaad is aangetoond dat deze techniek veilig ^10,11, hoewel voor transepicardial injectie open borstchirurgie noodzakelijk en transendocardial benaderingen een elektrofysiologische afbeelding voor elke patiënt moet plaatsen van levensvatbare ischemisch myocardium of littekens ⁹ differentiëren.

Belangrijk in celtherapie studies de keuze van de beste cel te transplanteren wordt nog onderzocht. Korte termijn analyses (4 weken) aan dat injectie van cardiale stamcellen gedefinieerd cardiospheres <sup> 12 of side population stamcellen uit beenmerg ¹³ geïnduceerde cardiale functioneel herstel in muizen ¹⁴ en rat ¹⁵ modellen van myocard infarct door het verminderen van litteken grootte en celdood. Allogene transplantatie van cardiospheres in een rat hartinfarct model zonder immunosuppressie werd veilig bevonden, bevorderd cardiale regeneratie, en een verbeterde hartfunctie door middel van stimulatie van endogene mechanismen reparatie ^15. Lin-/c-kit + volwassen progenitorcellen in het hart bleken zelf-vernieuwing, clonogene en multipotent in vitro es in vivo, en bij injectie in een ischemische rattehart gereconstitueerde grote delen van de verwonde hartspier ¹⁶ en hadden mogelijkheid om geleidende en intermediair-en kleinbedrijf kransslagaders ¹⁷ vormen. Deze veelbelovende gegevens aangewakkerd fase I en II klinische studies bij de mens: injectie van autologe en allogene mesenchymale stamcellen (MSC) ^18, cardiospheres ¹⁹Of c-Kit positieve cardiale stamcellen (CSC) 20 in ischemisch mensenharten elk werden voordelen van de hartfunctie in lange termijn studies. Toch uitgebreide lange termijn follow-up en een retrospectieve meta-analyse toonde aan dat stamceltherapie biedt aanzienlijke voordelen voor sommige patiënten, maar niet bij anderen met een bereik van onvoorspelbare uitkomsten ^21. Het is mogelijk dat deze beperkingen het ontwerp van specifieke protocollen cel levering voor ieder individu en ziekte noodzakelijk.

In muis en rat modellen, lange-termijn studies blijkt dat celinjectie geen verdere verbetering van de hartfunctie (12 maanden). Inderdaad, enten van menselijke embryonale stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hESC-CM) werden grotendeels geïsoleerd van de host myocard door een laag van fibrotische weefsel ^22,23. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen na intramyocardiale transplantatie van skeletmyoblasten naar het hart van geïnfarceerde muizen ^24. Furthermore, de lange termijn kan van allogene MSC om te functioneren in het infarct hart bewaren is beperkt door overgang van een immunoprivileged tot een immunogeen staat na differentiatie ^25.

Rekening houdend met de uitdagingen en vooruitzichten hierboven geschetste, tonen we hier hoe cellen leveren door intramyocardiale injectie bij muizen. We zien dat de cellen zonder cardiomyocyte contractiele eigenschappen niet verbonden met de gastheer myocard en vormen een samenhangende massa met een dunne fibrotische barrière. Hoewel in sommige gevallen uitkomst voordelig kunnen zijn, kan de volgende analyse nuttig zijn om te begrijpen hoe cellen innesteling kunnen variabel zijn om functioneel verbonden myocard structuren genereren ook.

Protocol

Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de internationale (Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement) en nationale (UK Home Office, Act 1986) regelgeving. De hierin beschreven procedures maken deel uit van ons plan van het werk volgens de Britse autoriteiten van afgifte en zijn niet uitgevoerd voor het doel van de opname. 1. Bereiding van Cellen Dit protocol beschrijft de bereiding van een bepaalde cellijn (humane embryonale nier, HEK293 cellen) …

Representative Results

Geïnjecteerd HEK293 cellen, die onderscheiden van de hartcellen door hun verschillende morfologie (figuur 1) zijn, met een geplaveide vorm opzichte van de langwerpige cardiomyocyten (Figuur 1A). HEK293 cellen waren meer reactief naar hematoxylin kleurstof (blauw) vergeleken met hartspiercellen (roze kleur), waarschijnlijk vanwege hun toegenomen nucleaire inhoud (figuur 1A). Om verder te onderscheiden van de geïnjecteerde cellen van het gastheerweefsel werden HEK293 ce…

Discussion

In dit manuscript, hebben we laten zien hoe intramyocardiale injectie van cellen uit te voeren in muizen harten. Als bewijs van deze methode, hebben we gebruik gemaakt HEK293 cellen. Het is belangrijk te benadrukken dat HEK293 cellen niet worden gebruikt in een celtherapie studie en de vaststellingen van dit manuscript zijn niet geschikt voor directe vertaling van een therapeutische benadering. Het feit dat HEK293 cellen niet contractiele cellen en niet transdifferentiëren in andere celtypen richt de aandacht op techni…

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T