心肌内细胞交货：观察在小鼠心脏

Summary

心血管疾病，如高血压或心肌梗死的小鼠模型心肌内细胞递送，被广泛用于测试在再生研究不同细胞类型的治疗潜力。因此，有详细说明，该手术过程有一个清晰的可视化将有助于确定在小型啮齿动物心血管细胞治疗分析的局限性和优势。

Abstract

以往的研究表明，细胞传递促进心功能改善细胞因子和增加心肌组织再血管化和细胞生存因子的释放。此外，进一步的观察发现，特定的干细胞，如心肌干细胞，间充质干细胞和cardiospheres有通过分化成心肌细胞，平滑肌细胞和内皮细胞周围的心肌内整合的能力。

这里，我们提出的材料和方法，以可靠地提供noncontractile细胞进入immunodepleted小鼠的左心室壁。其显着的步骤此显微程序涉及麻醉和镇痛注射液，气管插管，切开打开胸部和无菌30号针头和精密微升注射器暴露细胞的心脏和交付。

包括心脏收获，embeddi组织处理毫微克，切片及组织学染色显示心肌内注射细胞产生一小的伤害的心外膜区域，以及在心室壁上。 Noncontractile细胞被保留到免疫缺陷小鼠的心肌壁并分别由一层纤维组织，有可能从心脏压力和机械负载，以保护所包围。

Introduction

各种细胞输送协议已经在心血管疾病的小鼠和大鼠模型进行了测试与翻译这个实验过程在人类患者的效率，有效性和安全性的目的。在小型啮齿动物的心，心肌内细胞传递是传递细胞^1,2的最可行的方法，而在大鼠心脏顺行³和⁴逆行冠脉内细胞输注，也可以使用。这两种方法有很大的局限性和优势。经冠状动脉内途径细胞递送拥有注射在促进全球细胞传播³直接肌肉注射理论上的优势，但它也有引起冠状动脉栓塞^3,5的风险。在心肌内交付限制与机械性损伤，急性炎症，心肌损害^6,7关联。在人类中，细胞是心脏修复是通过心肌内注射，通过心内膜或心外膜的手术递送接近或冠状动脉内的动脉途径^8。注射液经血管途径适合于治疗急性脑梗死和心肌再灌注，但可能无法进行的情况下完全闭塞或受影响的领土⁹的血管里流动不畅的。直接注射到左心室壁通过经心或transepicardial注射在技术上是可行取决于病人的健康状况。事实上，已经表明，这种技术是安全的^10,11，尽管对于transepicardial注射是必要的开胸手术和经心方法是必需的，以区分存活缺血或心肌疤痕⁹的部位的电生理标测对每个病人。

重要的是，在细胞治疗研究的最佳细胞移植的选择仍在进一步调查中。短期的分析（4周）表明，注射定义为cardiospheres心脏干细胞的<s向上> 12或从骨髓¹³侧群细胞诱导的心功能恢复的小鼠¹⁴和大鼠模型¹⁵心肌梗塞通过减少瘢痕大小和细胞死亡。在没有免疫抑制大鼠心肌梗死模型cardiospheres同种异体移植被认为是安全的，促进心肌再生，并通过内源性修复机制¹⁵刺激改善心脏功能。在心脏Lin-/c-kit +能成体祖细胞被证明是自我更新，克隆，和多能在体外和体内 ，并且当注射到缺血大鼠心脏重构受伤的心肌壁¹⁶的大的部分和有能力，形成导电性和中等大小的冠状动脉^17。这些可喜的数据引发的I期和人类II期临床试验：注射自体和异体骨髓间充质干细胞^{（MSC）18，cardiospheres 19}，或c-Kit阳性心脏干细胞（CSC）20在缺血人类的心灵每个显示，在长期的研究心脏功能的有益作用。然而，大量的长期随访和回顾性荟萃分析表明，干细胞疗法提供了显著的好处有些病人，而不是在别人与一系列不可预知的结果^21。这是可能的，这些限制将需要的细胞递送的每个个人和每一种疾病的具体协议的设计。

在小鼠和大鼠模型中，长期的研究表明，细胞注射未进一步改善心脏功能（12个月）。的确，人胚胎干细胞衍生的心肌细胞（hESC细胞-CM）的移植物主要是由一层纤维组织^22,23的分离自宿主的心肌。骨骼肌成肌细胞心肌内移植到梗死小鼠²⁴的心脏后，类似的结果也被观察到。 Furthermo重，同种异体干细胞的保存功能中的梗塞心脏的长期能力已经通过从immunoprivileged到免疫原性的状态转移分化²⁵后受到限制。

考虑到上述挑战和前景，我们在这里展示如何通过心肌内注射小鼠，提供细胞。我们观察到细胞无心肌收缩性能不与宿主心肌相连形成一个粘合体具有薄纤维化障碍。尽管在某些情况下，这种结果可能是有利的，下面的分析可能是有用的，以了解细胞植入可被调制，以产生功能性连接的心肌的结构为好。

Protocol

所有动物实验均符合国际（欧洲议会指令2010/63/EU）和国家（英国内政部，1986法案）的规定执行。本文所述的方法是我们在英国的许可证主管部门的工作计划的一部分，并没有被进行记录的目的。 1。细胞的制备本协议描述了用于演示目的编制特定的细胞系（人类胚胎肾，HEK293细胞）。小区特定的协议必须采用用于生长并最终分化多能性或成体干细胞分化?…

Representative Results

我们注入的HEK293细胞中，这是由它们的不同的形态可区分从心脏细胞（ 图1），用鹅卵石形状较细长的心肌细胞（ 图1A）。相比，心肌细胞（粉红色），有可能的，因为它们的增加的核含量（ 图1A）的HEK293细胞，更具反应性，以苏木精染料（蓝色）。为了进一步区分注射的细胞从宿主组织中，将HEK293细胞用DAPI标记前2小时注射。标记的细胞是可见的心肌组织，…

Discussion

在这个手稿中，我们已经展示了如何在小鼠心脏进行心肌内注射细胞。作为这种方法的一个证据，我们已经使用HEK293细胞。需要强调的是HEK293细胞中的任何细胞治疗研究中没有使用，因此该手稿的发现并不适合直接翻译为一种治疗方法是很重要的。然而，事实是HEK293细胞不收缩细胞，不要在其他细胞类型转分化侧重于技术方面，例如要传送的单元的属性和传送路线的注意。

?…

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T