Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Summary

Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren.

Abstract

Frühere Studien haben gezeigt, dass Zellabgabe fördert Verbesserung der Herzfunktion durch Freisetzung von Zytokinen und Faktoren, die Herzgewebe Revaskularisation und das Überleben der Zelle zu erhöhen. Darüber hinaus sind weitere Beobachtungen zeigten, dass bestimmte Stammzellen, wie Herzstammzellen, mesenchymale Stammzellen und cardiospheres haben die Fähigkeit, innerhalb der umgebenden Myokard durch Differenzierung in Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und Endothelzellen zu integrieren.

Hier präsentieren wir die Materialien und Methoden, um zuverlässig zu liefern noncontractile Zellen in der linken Herzkammerwand der immunodepleted Mäusen. Die wesentlichen Schritte dieser mikrochirurgischen Verfahren beinhalten Anästhesie und Analgesie Injektion, intratracheale Intubation, Schnitt, um die Truhe zu öffnen und setzen das Herz und die Lieferung von Zellen durch eine sterile 30-Gauge-Nadel und einer Präzisionsmikroliter-Spritze.

Gewebeverarbeitung, bestehend aus Herz Ernte, embedding, Schneiden und histologische Färbung zeigte, dass intramyokardialer Zellinjektion erzeugt eine kleine Beschädigung in der epikardialen Fläche, als auch in der Herzkammerwand. Noncontractile Zellen in die Wand des Myokards immunsupprimierten Mäusen erhalten und wurden durch eine Schicht aus faserigem Gewebe, wahrscheinlich von Herz Druck und mechanischer Belastung zu schützen, umgeben ist.

Introduction

Verschiedene Zellabgabe-Protokolle in murinen und Rattenmodellen von kardiovaskulären Erkrankungen, die mit dem Ziel der Umsetzung der Effizienz, Wirksamkeit und Sicherheit dieser experimentellen Verfahren in menschlichen Patienten getestet. In kleinen Nager Herzen, ist intramyokardialen Zellabgabe die praktikabelste Methode der Zellabgabe ^1,2, während in der Rattenherzantegrade und retrograde ^{3 4} intrakoronare Infusion Zelle kann ebenfalls verwendet werden. Beide Methoden haben Grenzen und Vorteile. Zell Lieferung über die intrakoronare Route hat theoretischen Vorteile gegenüber der direkten intramuskuläre Injektion in die Förderung der weltweiten Verbreitung Zelle ^3, aber es hat auch die Gefahr, dass Herzkranzembolie ^3,5. Einschränkungen bei der Lieferung intramyokardialen sind mit mechanischen Verletzungen, akute Entzündungen und Herzmuskelschäden ^6,7 verbunden. Beim Menschen werden die Zellen für die Reparatur von Herz intramyokardiale Injektion durch eine endokardiale oder epikardiale chirurgischen zugenähern oder durch intrakoronare arteriellen Linie ^8. Injection von transvaskuläre Routen ist bei Patienten mit akutem Infarkt und Herzmuskel reperfundierten geeignet, kann aber nicht möglich sein, im Falle von Totalverschlüssen oder schlechte Fluss innerhalb der Gefäße des Gebietes erfolgen ^9. Direkte Injektion in die Herzkammerwand durch transendokardialen oder transepikardialen Injektion technisch möglich je nach Patient Gesundheitszustand. Tatsächlich hat es sich gezeigt, dass diese Technik sicher ^10,11, obwohl für transepikardialen Injektion eine offene Brustchirurgie notwendig ist und für ein elektro transendokardialen nähert Zuordnung für jeden Patienten erforderlich ist, um lebensfähige Stellen von ischämischen oder vernarbten Herzmuskel ⁹ unterscheiden.

Wichtig ist, dass in der Zelltherapie-Studien die Auswahl der besten Zelle zu trans wird noch untersucht. Kurzzeitanalysen (4 Wochen) zeigten, dass die Injektion von Herzstammzellen definiert als cardiospheres <sbis> 12 oder Side Population Zellen aus Knochenmark ¹³ induziert Herz funktionelle Erholung in Maus und Ratte ^{14 15} Modelle von Myokardinfarkt durch eine Verringerung der Narbengröße und Zelltod. Die allogene Transplantation von cardiospheres in einem Rattenmodell Myokardinfarkt ohne Immunsuppression wurde festgestellt, um sicher zu sein, förderte Herzregeneration und verbessert die Herzfunktion durch Stimulation der körpereigenen Reparaturmechanismen ^15. Lin-/c-kit + adulte Progenitorzellen im Herzen wurde gezeigt, dass selbst erneuernde, klonogenen und multi in vitro und in vivo, und wenn in einem ischämischen Rattenherzen injiziert rekonstituiert große Teile des verletzten Myokard-Wand ¹⁶ und hatte die Fähigkeit, leitende und mittelgroße Koronararterien ¹⁷ zu bilden. Diese viel versprechenden Daten angeheizt Phase I und II der klinischen Studien am Menschen: Injektion von autologen und allogenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) ^{18, 19} cardiospheresOder c-Kit positive Herzstammzellen (CSC) 20 in ischämischen Herzen der Menschen zeigten jeweils positiven Auswirkungen auf die Herzfunktion in Langzeitstudien. Dennoch umfangreiche Langzeit-Follow-up-und retrospektive Meta-Analyse zeigte, dass die Stammzelltherapie einen wesentlichen Nutzen für einige Patienten, in anderen aber nicht mit einer Reichweite von ²¹ unvorhersehbare Ergebnisse. Es ist möglich, dass diese Einschränkungen wird das Design von spezifischen Protokollen der Zellabgabe für jeden einzelnen und jede Erkrankung erfordern.

In Maus-und Rattenmodellen zeigten Langzeitstudien, dass Zellinjektion nicht weiter Herzfunktion (12 Monate) zu verbessern. Tatsächlich Transplantate von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (hES-CM) wurden weitgehend von der Host-Myokard durch eine Schicht von fibrotischen Gewebes ^22,23 isoliert. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Transplantation von intramyokardialen Skelettmyoblasten in das Herz des infarzierten Mäusen ²⁴ beobachtet. Furthermore, die langfristige Möglichkeit der allogenen MSCs Funktion in der Infarkt Herzen bewahren durch Übergang von einer immun eine immunogene Zustand nach Differenzierung ²⁵ begrenzt.

Unter Berücksichtigung der Herausforderungen und Perspektiven oben dargelegt, zeigen wir hier, wie man Zellen durch intramyokardialen Injektion in Mäusen zu liefern. Wir beobachten, dass Zellen ohne Herzmuskelkontraktionseigenschaften nicht mit dem Host-Myokard verbunden und bilden eine zusammenhängende Masse mit einer dünnen fibrotischen Barriere. Obwohl in einigen Fällen dieses Ergebnis kann vorteilhaft sein, kann die folgende Analyse nützlich sein, um zu verstehen, wie Zelltransplantations kann moduliert werden, um funktionsfähig verbunden myokardialen Strukturen sowie zu erzeugen.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit internationalen (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments) und nationale (UK Home Office, Act 1986) Bestimmungen durchgeführt. Die hier beschriebenen Verfahren sind Teil unseres Arbeitsplan nach britischem Lizenz Behörden und wurden nicht zum Zwecke der Aufnahme durchgeführt. 1. Herstellung von Zellen Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer bestimmten Zelllinie (Human Embryonic Kidney, HEK293-Z…

Representative Results

Wir injizierten HEK293-Zellen, die unterscheidbar von der Herzzellen durch ihre unterschiedliche Morphologie (Fig. 1) sind, mit einer Kopfsteinform im Vergleich zu den länglichen Kardiomyozyten (Fig. 1A). HEK293-Zellen waren zu Hämatoxylin Farbstoff (blaue Farbe) reaktiven Vergleich zu Kardiomyozyten (rosa Farbe), wahrscheinlich wegen ihrer erhöhten Kerngehalt (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterscheidung der injizierten Zellen aus dem Wirtsgewebe wurden HEK293-Zellen …

Discussion

In diesem Manuskript haben wir gezeigt, wie man intramyokardialen Injektion von Zellen in murinen Herzen durchzuführen. Als Beweis dieser Methodik haben wir HEK293-Zellen verwendet. Es ist wichtig zu betonen, dass HEK293-Zellen sind nicht in einer Zelltherapie Studie verwendet und damit die Ergebnisse des Manuskripts für die direkte Übersetzung zu einem therapeutischen Ansatz nicht geeignet sind. Die Tatsache, dass HEK293-Zellen nicht kontraktilen Zellen und nicht in anderen Zelltypen zu trans Aufmerksamkeit konzentr…

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T