דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes
Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך להפקת וטיהור מסוג בר וגרסאות מוטציה של מתחם שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי. Epitope מתויג גרסאות של יחידות משנה INO80 באות לידי ביטוי ביציבות בתאי HEK293, ומתחמים שלמים ומתחמים חסרי מערכות ספציפיות של יחידות משנה הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה immunoaffinity.
Abstract
מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 להסדיר דינמיקת הנוקלאוזום ונגישות DNA על ידי מזרזות שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP. מתחמי INO80 אדם מורכבים מ14 יחידות משנה חלבון כולל Ino80, ATPase כמו SNF2, המשמש גם כמקטע קטליטי והפיגום להרכבה של המכלולים. פונקציות של יחידות משנה האחרות והמנגנונים שבאמצעותם הם תורמים לפעילות שיפוץ הכרומטין של מתחם INO80 להישאר הבינו היטב, בין שאר בשל האתגר של יצירת מכלולי INO80 בתאים אנושיים או מערכות ביטוי Heterologous. פרוטוקול יופיטר זה מתאר הליך המאפשר טיהור של subcomplexes שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי שחסרי מקטע או קבוצת משנה של יחידות משנה. epitope דגל N-סופני מתויג Ino80 cDNA הם הציגו ביציבות לכליה עוברית אנושית (HEK) 293 שורות תאים באמצעות רקומבינציה בתיווך FLP. במקרה שקבוצת משנה של יחידות משנה של מתחם INO80 הוא bדואר שנמחק, אחד מבטא חלבוני Ino80 במקום מוטציה שחסר את הפלטפורמה הנדרשת להרכבה של תת יחידות אלה. באירוע למקטע בודד הוא להיות מדולדל, siRNAs אחד transfects מיקוד למקטע זה לשורת תאי HEK 293 יציבות להביע FLAG tagged Ino80 ATPase. תמציות גרעיניות מוכנות, וimmunoprecipitation FLAG מתבצעת על מנת להעשיר את השברים חלבון המכילים נגזרי Ino80. הקומפוזיציות של subcomplexes INO80 מטוהר לאחר מכן ניתן לנתח באמצעות שיטות כגון immunoblotting, צביעת כסף, וספקטרומטריית מסה. Subcomplexes INO80 וINO80 שנוצר על פי פרוטוקול זה ניתן לנתח נוסף באמצעות מבחני ביוכימיים שונים, אשר מתוארים בפרוטוקול יופיטר הנלווה. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מותאמות ללימודים של התכונות המבניות ותפקודיות של כל שיפוץ הכרומטין רב למקטע של יונקים ומתחמי שינוי.
Introduction
מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 אבולוציונית שמורים הם רגולטורים מרכזיים של ארגון הכרומטין ונגישות DNA 1. מתחמי שיפוץ אלה תמיד כוללים מקטע מרכזי כמו SNF2-ATPase, אשר, במקרים מסוימים, מרכיב בחלבוני אבזר שונים ויוצר מכלולי מקרו מולקולרי רב למקטע. כדי לחקור את הפרטים המולקולריים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, זה חשוב להבין את תרומתם של תת קבוצות מסוימות של יחידות משנה ו / או מבני תחום לפעילות של מתחמים. ניתוח מסוג זה דורש את היכולת ליצור מתחמי מוטציה נקיים במיוחד שחסרות יחידות משנה חלבון מסוימות או מבני תחום.
מחקרי מבנה פונקציה קודמים של מתחמי שיפוץ הכרומטין תלוי ATP התמקדו באופן נרחב במערכת שמרי המודל בשל manipulability מעולה של הגנום השמרים (ראה, למשל, שופטים 1-4). בהתחשב בשימורהרכב למקטע ופונקציונליות בין מתחמי שיפוץ orthologous, מחקרים של המבנה והתפקוד של קומפלקסי שיפוץ שמרים סיפקו תובנות חשובות עמיתיהם באאוקריוטים גבוהים יותר. עם זאת, מינים ספציפיים ניכרים הבדלים בין מתחמי שיפוץ קיימים, כתוצאה מרווח או הפסד של מינים ספציפיים יחידות משנה, הרווח או הפסד של תחומים מינים ספציפיים של יחידות משנה נשמרו, והשתנות רצף בתוך תחומים משומרים של יחידות משנה נשמרת. יכולים באופן עקרוני להיות מונעים את ההבדלים כאמור על ידי הצורך בתאים האיקריוטים גבוהים יותר להסתגל לסביבות מולקולריות ותאיות חדשות. לפיכך, ההבנה כיצד יחידות משנה של מתחמי שיפוץ אוקריוטים גבוהים לתרום לתהליך שיפוץ הנוקלאוזום היא בעל ערך, כי זה לא רק גם שופך אור על מנגנונים בסיסיים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, אבל יכול לספק תובנה חשובה המנגנונים שבאמצעותם מבנה הכרומטין וביטוי גנים בפואאוקריוטים מוסדרים.
עד כה, יש כבר מוגבל רק מחקרים מבניים ותפקודיים של מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים רב למקטע, נובע בחלקו בקשיים בהשגת מתחמים מוגדרים ביוכימית הכרומטין שיפוץ וsubcomplexes. באופן חלקי יש לנו לעקוף את הקשיים הללו לנהלים שיפורטו להלן, שבו לטיהור immunoaffinity משמשת להכנת subcomplexes INO80 או INO80 שלם מהתאים אנושיים ביציבות להביע epitope דגל N-סופני מתויג סוג בר או גרסאות מוטציה של Ino80 5-7 (איור 1) . כדי להשיג מתחמי INO80 שלמים מהתאים אנושיים, רקומבינציה בתיווך FLP משמשת ליצירת שורות תאי HEK293 מהונדסים ביציבות להביע cDNAs מתויגים epitope דגל קידוד יחידות משנה של המתחם INO80 8-10. בגלל ביטוי יתר של יחידות משנה INO80 יכול להיות רעיל במידה מסוימת, יש צורך לבודד ולשמור על שורות תאים משובטים תחת שיתוף סלקטיביnditions כדי להבטיח ביטוי transgene יציב במהלך הקטעים רבים הנדרשים להרחבה של תרביות תאים בקנה מידה גדולה. כדי להשיג subcomplexes INO80 קטן יותר המכיל רק קבוצת משנה של יחידות משנה, השתמשנו בהצלחה שתי גישות (איור 2 א, ב '). בחלק הראשון, אנו יוצרים שורות תאי HEK293 FLP-In ביציבות להביע גרסאות מוטציה של Ino80 שחסרת תחומים הנדרשים לאינטראקציה עם יחידות משנה ספציפיות 5. לחלופין, מציאה בתיווך siRNA משמשת לרוקן למקטע הרצוי מהתאים לבטא מקטע מתאים מתויג דגל INO80 (נתונים שלא פורסמו). לבסוף, כדי לטהר את מתחמי INO80 האנושיים, כרומטוגרפיה המבוססת agarose FLAG 11 משמשת להעשרת חלק המכיל INO80 מתמציות גרעיניות, ובכך מפחיתה ביעילות את נוכחותם של חלבונים מזהמים cytosolic בשבריר הסופי המכיל subcomplexes INO80 או INO80 המטוהר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים מבניים ותפקודיים של רב למקטע מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים מאאוקריוטים גבוהים כבר הקשו על ידי הקושי של הכנה ביוכימית כמויות שימושיות של מתחמים כגון המכילים יחידות משנה שעברו מוטציה או חסרי יחידות משנה מסוימות לגמרי. ישנם מספר של מכשולים טכניים: ראשית, מניפולצי…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה במעבדה של המחברים נתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (GM41628) ועל ידי מענק למכון Stowers למחקר רפואי מהלן נלסון רפואי קרן המחקר בקרן קהילת קנזס רבתי העיר.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
Referencias
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
