発生と人間INO80クロマチンリモデリング複合体とSubcomplexesの精製
Summary
このプロトコルは、野生型と人間INO80クロマチンリモデリング複合体の変異型を生成し、精製するための手順を説明します。エピトープはINO80サブユニットのバージョンが安定してHEK293細胞で発現されタグ付けされ、サブユニットの特定のセットを欠いている完全な複合体と複合体を、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。
Abstract
INO80クロマチンリモデリング複合体は、ATP依存性ヌクレオソームのリモデリングを触媒することによってヌクレオソームのダイナミクスとDNAのアクセシビリティを調節する。人間INO80複合体は、触媒サブユニットとの複合体のアセンブリのための足場とを兼ねINO80、SNF2様ATPアーゼを含む14のタンパク質サブユニットから構成されています。他のサブユニットと、彼らはINO80複合体のクロマチンリモデリング活性に寄与するメカニズムの機能は、人間の細胞または異種発現系にINO80サブアセンブリを生成するという課題に一部、よくわかっていないままである。このJOVEプロトコルは、サブユニットまたはサブユニットのサブセットを欠いている人間INO80クロマチンリモデリングsubcomplexesの精製を可能にする手順について説明します。 N末端のFLAGエピトープはINO80するcDNAを安定的にタグ付けされたヒト胚腎臓（HEK）のFlp介在組換えを用いて293細胞株に導入される。 INO80複合体のサブユニットのサブセットがb側にある場合でeは削除された、人はこれらのサブユニットの組み立てに必要なプラットフォームを欠いている代わりに、変異体INO80タンパク質を発現。イベントでは、個別のサブユニットが枯渇する場合には、安定的にFLAGを発現するHEK 293細胞株に、このサブユニットをターゲットに1トランスフェクトするのsiRNAはINO80 ATPアーゼは、タグ付き。核抽出物を調製し、FLAG免疫沈降はINO80誘導体を含有するタンパク質画分を濃縮するために行われる。精製INO80のsubcomplexesの組成物は、その後、免疫ブロッティング、銀染色、および質量分析などの方法を用いて分析することができる。このプロトコルに従って生成INO80およびINO80 subcomplexesは、添付JOVEプロトコルに記載されているさまざまな生化学的アッセイを用いて分析することができる。ここに記載される方法は、任意の哺乳動物マルチサブユニットクロマチンリモデリングの構造的および機能的特性の研究及び改変する複合体に適合させることができる。
Introduction
進化的に保存されたSNF2ファミリークロマチンリモデリング複合体はクロマチン組織とDNAのアクセシビリティ1の重要な調節因子である。これらのリモデリング複合体は常にいくつかのケースでは、さまざまなアクセサリータンパク質で組み立て、マルチサブユニットの巨大分子集合体を形成し、中央SNF2様ATPアーゼサブユニットを含む。 ATP依存性クロマチンリモデリングプロセスの分子的詳細を研究するためには、複合体の活動サブユニットおよび/またはドメイン構造の所定のサブセットの寄与を理解することが重要である。このような分析は、特定のタンパク質サブユニットまたはドメイン構造を欠いている高度に精製された変異体の複合体を生成する能力が必要です。
ATP依存性クロマチンリモデリング複合体の以前の構造-機能研究が広く（参考文献1-4等参照）により、酵母ゲノムの優れた操作性に酵母モデル系に焦点を当てている。の保全を考えるオーソロガスモデリング複合体のうち、サブユニット組成と機能性、酵母リモデリング複合体の構造と機能の研究は、高等真核生物における対応に重要な洞察を提供してきました。それにもかかわらず、リモデリング複合体の中でかなりの種特異的な違いは、保存されたサブユニットの保存されたドメイン内の利得または種特異的サブユニットの喪失、保存されたサブユニットの種特異的なドメインの損益、および配列変動に起因する、存在します。このような差異は、原理的には高等真核細胞が新たな分子および細胞環境に適応する必要性によって駆動することができる。それはATP依存性クロマチンリモデリングプロセスの基本的なメカニズムに光を投げかけて、だけでなく、そのクロマチン構造メカニズムに貴重な洞察を提供することができませんという理由だけでこのように、高等真核生物のリモデリング複合体のサブユニットはヌクレオソームのリモデリングプロセスに寄与するかを理解することは、価値があるHIG内および遺伝子発現彼女の真核生物が規制されている。
これまでのところ、生化学的に定義されたクロマチンリモデリング複合体とsubcomplexesを得ることが困難に一部起因マルチサブ哺乳類のクロマチンリモデリング複合体の限られた構造的および機能的研究が行われている。私たちは、野生型またはINO80 5-7の変異型（ 図1）タグ付き免疫親和性精製を安定的にN末端FLAGエピトープを発現するヒト細胞から無傷INO80またはINO80 subcomplexesを調製するために使用される下記の手順を用いてこれらの問題を部分的に回避している。ヒト細胞から無傷INO80複合体を得るために、のFlp介在組換えを安定INO80複合体8-10のサブユニットをコードするFLAGエピトープタグ付きcDNAを発現するトランスジェニックHEK293細胞株を生成するために使用される。 INO80サブユニットの過剰発現がいくらか毒性であり得るため、単離および選択的共同下クローン細胞系を維持するために必要であるnditions大規模な細胞培養の増殖のために必要な多くの通路の間に安定した導入遺伝子発現を保証する。サブユニットのサブセットのみが含まれている小さなINO80のsubcomplexesを得るために、正常に2つのアプローチを使用した（ 図2A、B）。まず、当社は安定的に特定のサブユニット5との相互作用に必要なドメインを欠いているINO80の変異型を発現するHEK293 FLP-Inの細胞株を作製。または、siRNAによるノックダウンは、適切なFLAGタグINO80サブユニット（未発表データ）を発現する細胞から目的のサブユニットを枯渇させるために使用されます。最後に、人間INO80複合体を精製するために、FLAGアガロースベースのクロマトグラフィー11は、効果的に精製されたINO80またはINO80 subcomplexesを含む最終画分に細胞質ゾル汚染タンパク質の存在を減らし、核抽出物からINO80を含む画分を濃縮するために使用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
高等真核生物から多サブ哺乳類のクロマチンリモデリング複合体の構造と機能の研究は、変異型サブユニットを含むか、完全に特定のサブユニットを欠いているような複合体の生化学的に有用な量を準備することの難しさによって妨げられてきた。技術的なハードルがいくつかあります：最初に、哺乳動物細胞における遺伝子操作は技術的に困難で時間がかかるしています。そのゲノムが容?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らの研究室での作業は一般的な医学研究所（GM41628）からの助成金によってグレーターカンザスシティコミュニティ財団のヘレン·ネルソン医学研究基金からの医学研究のためのStowers研究所への補助金によってサポートされています。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
Referencias
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