Генерация и очистка человека INO80 хроматина комплексов и подкомплексов
Summary
Этот протокол описывает процедуру для генерации и очистки дикого типа и мутантных версий человеческого INO80 хроматина комплекса. Эпитопов помечены варианты субъединиц INO80 стабильно экспрессируются в клетках НЕК293, и полные комплексы и комплексы, не имеющие конкретные наборы субъединицы очищают иммуноаффинной хроматографии.
Abstract
INO80 хроматина комплексы регулируют нуклеосом динамику и доступность ДНК катализирует АТФ-зависимый нуклеосом ремоделирования. Человеческие комплексы INO80 состоять из 14 белковых субъединиц, включая Ino80, в SnF2-как АТФ-азы, которая служит и как каталитической субъединицы и эшафот для сборки комплексов. Функции других подразделений и механизмы, с помощью которых они вносят вклад в хроматина деятельности INO80 комплекса остаются плохо понятыми, частично в связи с проблемой генерации INO80 узлы в клетках человека или гетерологичных системах экспрессии. Этот протокол JOVE описывает процедуру, позволяющую очистку человека INO80 хроматина подкомплексов, которых не хватает субъединицу или подмножество субъединиц. N-терминальной ФЛАГ эпитоп помечены Ino80 кДНК стабильно вводится в человеческой эмбриональной почки (НЕК) 293 клеточных линий с использованием Flp-опосредованной рекомбинации. В том случае, если подмножество субъединиц INO80 комплекс бэ удален, один выражает вместо мутантные белки Ino80, которые не имеют платформу, необходимую для сборки этих субъединиц. В случае индивидуальный субъединица, будут исчерпаны, один transfects миРНК в интересах этой субъединицы в НЕК 293 клеточной линии, стабильно экспрессирующие FLAG помечены Ino80 АТФазы. Ядерные экстракты получают, и FLAG иммунопреципитацию выполняется для обогащения белковые фракции, содержащие производные Ino80. Композиции очищенной INO80 подкомплексов затем могут быть проанализированы с использованием таких методов, как иммуноблоттинга, окрашиванием серебром и масс-спектрометрии. В INO80 и INO80 подкомплексы генерируемые в соответствии с этим протоколом можно дополнительно проанализированы с использованием различных биохимических анализов, которые описаны в протоколе сопроводительной Юпитера. Методы, описанные здесь, могут быть адаптированы для исследований структурных и функциональных свойств любого млекопитающего мульти-субъединицы хроматина и модифицирующих комплексов.
Introduction
Эволюционно консервативные SnF2 семейные хроматина комплексы являются ключевыми регуляторами организации хроматина и ДНК доступности 1. Эти ремоделирования комплексы всегда включать в себя центральный SNF2-как АТФазную субъединицы, которая, в некоторых случаях, собирает с различными вспомогательными белками и образует макро-молекулярных ансамблей из множества субъединиц. Для изучения молекулярных детали процесса ремоделирования хроматина АТФ-зависимой, важно понять вклад заданных подмножеств субъединиц и / или доменных структур в деятельности комплексов. Такие анализы требуют способность генерировать высокоочищенные мутантные комплексы, которые не имеют особых белковых субъединиц или доменные структуры.
Предыдущие исследования структурно-функциональной организации АТФ-зависимых ремоделирования хроматина комплексов широко сосредоточены на дрожжи модельной системы в связи с повышенной манипулируемости генома дрожжей (см, например, в работах 1-4). Учитывая сохранениеСостав субъединицы и функциональность среди ортологичных ремоделирования комплексов, исследования структуры и функции дрожжей ремоделирования комплексов, стал важным вкладом в их коллегами в высших эукариот. Тем не менее, заметные конкретным видам различия между ремоделирования комплексов существуют, в результате прибыль или убыток от конкретного вида субъединиц, прибыль или убыток от видовой определенных доменов сохраняющихся субъединиц, и изменчивости последовательности внутри консервативных областей сохраняющихся субъединиц. Такие различия могут быть в принципе обусловлена необходимостью для высших эукариотических клеток адаптироваться к новым молекулярных и клеточных средах. Таким образом, понимание того, как подразделения высших эукариот ремоделирования комплексов способствовать нуклеосомнои процесса ремоделирования является ценным, потому что это не только проливает свет на основные механизмы АТФ-зависимый процесс ремоделирования хроматина, но и могут предоставить ценную информацию о механизмах, с помощью которых структура хроматина и экспрессии генов в теплицаее эукариоты регулируются.
До сих пор, там были только ограничены структурные и функциональные исследования нескольких субъединиц млекопитающих ремоделирования хроматина комплексов, отчасти с трудностями в получении биохимически определенные хроматина комплексов и подкомплекса. Мы частично обойти эти трудности с процедурами, описанными ниже, в которых очистка иммуноаффинная используется для подготовки нетронутыми INO80 или INO80 подкомплекса из человеческих клеток, стабильно экспрессирующих N-терминальной ФЛАГ эпитоп помечены дикого типа или мутантные версии Ino80 5-7 (Рисунок 1) . Чтобы получить интактные INO80 комплексов из клеток человека, FLP-опосредованной рекомбинации используется для генерации трансгенных клеточных линий HEK293, стабильно экспрессирующих эпитоп FLAG с тегом кДНК, кодирующие субъединицы комплекса INO80 8-10. Потому что над-выражение INO80 субъединиц может быть ядовиты, необходимо изолировать и поддерживать клонированных клеточных линий под селективного сотрудничестваnditions обеспечить стабильную экспрессию трансгена в течение многих пассажей, необходимых для расширения культур крупномасштабных клеток. Для получения более мелких подкомплекса INO80, которые содержат только подмножество субъединиц, мы успешно использовали два подхода (2А, Б). В первый, мы генерируем HEK293 Flp-в клеточных линиях, стабильно экспрессирующие мутантные версии Ino80, которые не имеют домены, необходимые для взаимодействия с конкретными подразделениями 5. Кроме того, миРНК-обусловленный нокдаун используется истощать нужный субъединицы от клеток, экспрессирующих соответствующий FLAG-меткой INO80 субъединицы (неопубликованные данные). Наконец, для очистки комплексов INO80 человека, флаг агарозы на основе хроматографии 11 используется для обогащения в INO80 фракцию, содержащую от нуклеарных экстрактов, посредством этого эффективно уменьшая присутствие загрязняющих цитозольных белков в конечном фракции, содержащие очищенный INO80 или INO80 подкомплексов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Структурные и функциональные исследования нескольких субъединиц млекопитающих ремоделирования хроматина комплексов из высших эукариот были мешали трудности подготовки биохимически полезные количества таких комплексов, содержащих мутантные субъединицы или вообще отсутствуют нек…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в лаборатории авторов поддерживается грантом Национального института общих медицинских наук (GM41628) и грантом на Stowers института медицинских исследований от Фонда Хелен Нельсон медицинских исследований в Общественный фонд Greater Канзас-Сити.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
Referencias
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
