Generación y purificación de Humanos INO80 remodelación de la cromatina complejos y Subcomplejos
Summary
Este protocolo describe un procedimiento para la generación y purificación de tipo salvaje y versiones mutantes del complejo de remodelación de la cromatina INO80 humano. Etiquetadas con epítopo versiones de subunidades INO80 se expresaron de manera estable en células HEK293, y los complejos completos y complejos que carecen de conjuntos específicos de subunidades se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad.
Abstract
Complejos remodeladores de cromatina INO80 regulan la dinámica de nucleosomas y la accesibilidad de ADN al catalizar la remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. Ino80 Humanos constan de 14 subunidades de proteínas incluyendo Ino80, un SNF2-como ATPasa, que sirve tanto como la subunidad catalítica y el andamio para el ensamblaje de los complejos. Funciones de las otras subunidades y los mecanismos por los que contribuyen a la actividad de remodelación de la cromatina del complejo INO80 siguen siendo poco conocidos, en parte debido al desafío de generar subconjuntos INO80 en células humanas o sistemas de expresión heteróloga. Este protocolo JOVE describe un procedimiento que permite la purificación de subcomplexes remodelación de la cromatina INO80 humanos que carecen de una subunidad o un subconjunto de subunidades. N-terminal BANDERA epítopo etiquetados cDNA Ino80 se introducen de manera estable en el riñón embrionario humano (HEK) 293 líneas celulares que utilizan la recombinación mediada por FLP. En el caso de que un subconjunto de subunidades del complejo INO80 es abe borrado, uno expresa las proteínas mutantes Ino80 vez que carecen de la plataforma necesaria para el montaje de esas subunidades. En el caso de una subunidad individual es a agotarse, uno transfecta siRNAs dirigidos a esta subunidad en una línea celular HEK 293 que expresan establemente FLAG etiquetados Ino80 ATPasa. Nuclear extractos se preparan, e inmunoprecipitación FLAG se realiza para enriquecer las fracciones de proteínas que contienen derivados Ino80. Las composiciones de subcomplexes INO80 purificados a continuación, se pueden analizar utilizando métodos tales como la inmunotransferencia, la tinción con plata, y espectrometría de masas. Los subcomplexes INO80 y INO80 generados de acuerdo con este protocolo se pueden analizar posteriormente utilizando diversos ensayos bioquímicos, que se describen en el protocolo JOVE acompaña. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar para los estudios de las propiedades estructurales y funcionales de cualquier remodelación de la cromatina multi-subunidad de mamíferos y en complejos de modificadores.
Introduction
Complejos remodeladores de cromatina familiares SNF2 conservadas evolutivamente son reguladores clave de la organización de la cromatina y la accesibilidad de ADN 1. Estos complejos de remodelación siempre incluyen una subunidad ATPasa-SNF2 como central, que, en algunos casos, se reúne con diversas proteínas accesorias y forma de múltiples subunidades asambleas macromoleculares. Para estudiar los detalles moleculares del proceso de remodelación de la cromatina dependiente de ATP, es importante para entender las contribuciones de los subconjuntos dados de subunidades y / o estructuras de dominio a las actividades de los complejos. Tales análisis requieren la capacidad de generar complejos de mutantes altamente purificados que carecen de subunidades de proteínas particulares o estructuras de dominio.
Anteriores estudios de estructura-función de los complejos de remodelación de la cromatina dependientes de ATP han ampliamente centrado en el sistema modelo de levadura debido a la manipulabilidad superior del genoma de la levadura (véase, por ejemplo, refs 1-4). Dada la conservación de loscomposición de la subunidad y funcionalidad entre los complejos de remodelación de ortólogos, los estudios sobre la estructura y función de los complejos de remodelación de levadura han aportado importantes conocimientos sobre sus homólogos en eucariotas superiores. No obstante, existen especies específicas apreciables diferencias entre los complejos de remodelación, que resulta de la ganancia o pérdida de especies específicas de subunidades, la ganancia o pérdida de los dominios específicos de especies de subunidades conservados, y la secuencia de la variabilidad dentro de dominios conservados de subunidades conservados. Estas diferencias no pueden en principio ser impulsados por la necesidad de que las células eucarióticas superiores para adaptarse a nuevos entornos moleculares y celulares. Por lo tanto, la comprensión de cómo las subunidades de los complejos de remodelación de eucariotas superiores contribuyen al proceso de remodelación nucleosoma es valiosa, ya que no sólo arroja luz sobre los mecanismos básicos del proceso de remodelación de la cromatina dependiente de ATP, pero también puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos por los que la estructura de la cromatina y la expresión génica en higsus eucariotas están regulados.
Hasta el momento, sólo se han limitado los estudios estructurales y funcionales de los complejos de remodelación de la cromatina de mamíferos múltiples subunidades, debido en parte a las dificultades en la obtención de los complejos de remodelación de la cromatina bioquímicamente definidos y subcomplexes. Hemos eludido parcialmente estas dificultades con los procedimientos descritos a continuación, en el que la purificación de inmunoafinidad se utiliza para preparar INO80 o INO80 subcomplexes intactos de las células humanas que expresan establemente N-terminal FLAG epítopo etiquetado de tipo salvaje o versiones mutantes de Ino80 5-7 (Figura 1) . Para obtener complejos de INO80 intactos de las células humanas, la recombinación mediada por FLP se utiliza para generar líneas celulares transgénicas HEK293 que expresan de forma estable epítopo FLAG ADNc etiquetados que codifican subunidades de los complejos INO80 8-10. Debido a la sobre expresión de subunidades INO80 puede ser algo tóxicos, es necesario aislar y mantener líneas celulares clonales menores de co selectivanditions para asegurar la expresión transgénica estable durante los muchos pasajes necesarios para la expansión de los cultivos celulares a gran escala. Para obtener subcomplexes INO80 más pequeños que contienen solamente un subconjunto de subunidades, hemos utilizado con éxito dos enfoques (Figura 2A, B). En la primera, generamos líneas celulares HEK293 Flp-In que expresan de forma estable versiones mutantes de Ino80 que carecen de dominios requeridos para la interacción con las subunidades específicas 5. Alternativamente, mediada desmontables-siRNA se utiliza para agotar la subunidad deseada a partir de células que expresan una subunidad INO80 marcado con FLAG apropiado (datos no publicados). Por último, para purificar los complejos INO80 humanos, FLAG cromatografía basada agarosa 11 se utiliza para enriquecer la fracción que contiene INO80-a partir de extractos nucleares, lo que reduce de manera efectiva la presencia de proteínas contaminantes citosólicas en la fracción final que contiene INO80 o INO80 subcomplexes purificados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios estructurales y funcionales de múltiples subunidades complejos de remodelación de la cromatina de mamíferos a partir de eucariotas superiores se han visto obstaculizados por la dificultad de preparar bioquímicamente cantidades útiles de tales complejos que contienen subunidades mutantes o que carecen de ciertas subunidades completo. Hay un número de obstáculos técnicos: En primer lugar, la manipulación genética en células de mamíferos ha sido técnicamente difícil y consume mucho tiempo. A dife…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo en el laboratorio de los autores es apoyada por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (GM41628) y con una donación al Instituto Stowers de Investigación Médica de la Fundación para la Investigación Médica Nelson Helen en la Fundación de la Comunidad metropolitana de Kansas City.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
Referencias
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