عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
واحدة جزيء المجهري والناشئة باعتبارها طريقة فعالة لتحليل سلوك الجزيئات مما يشير، ولا سيما فيما يتعلق بتلك الجوانب (على سبيل المثال، حركية، التعايش بين مختلف الدول والشعوب، والتفاعلات عابرة)، التي خبأتها عادة في القياسات الفرقة، مثل تلك التي حصلنا عليها مع أساليب الكيمياء الحيوية أو المجهري القياسية. وبالتالي، الأحداث الحيوية، مثل التفاعلات مستقبلات مستقبلات، يمكن اتباعها في الوقت الحقيقي في الخلية الحية لقرار الزمانية المكانية العالية. يصف هذا البروتوكول أسلوب يعتمد على وضع العلامات مع fluorophores العضوية الصغيرة ومشرق ومجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهري لتصور مباشرة المستقبلات واحد على سطح الخلايا الحية. هذا النهج يسمح احد لتوطين بالضبط المستقبلات، وقياس حجم المجمعات مستقبلات، والتقاط الأحداث الديناميكية مثل عابرة التفاعلات مستقبلات مستقبلات. يوفر بروتوكول وصفا مفصلا لكيفية المؤسسة العامةrform تجربة واحدة جزيء، بما في ذلك إعداد العينات، والحصول على الصور وتحليل الصور. على سبيل المثال، تطبيق هذا الأسلوب لتحليل اثنين G-مستقبلات البروتين يقترن، مثال.، β 2 الأدرينالية وγ أمينوبتيريك نوع حمض B (GABA B) مستقبلات، ويقال. البروتوكول يمكن تكييفها لغيرها من البروتينات الغشاء ونماذج مختلفة من الخلايا، وأساليب ترنسفكأيشن واستراتيجيات التوسيم.
Introduction
المستقبلات الموجودة على سطح الخلية الشعور البيئة خارج الخلية والرد على مجموعة متنوعة من المحفزات، مثل عطر، والأيونات، والهرمونات العصبية الصغيرة البروتين كبيرة. طبيعة السائل من الأغشية الخلوية يسمح تحركات المستقبلات والبروتينات الغشاء الأخرى. هذا أمر ضروري لتشكيل مجمعات البروتين وحدوث عابرة البروتين البروتين التفاعلات، مثل تلك المستخدمة من قبل المستقبلات إلى التجمع في وحدات وظيفية وتنبيغ إشارات إلى داخل الخلية. على سبيل المثال، وقد اقترحت G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs)، والتي تشكل أكبر عائلة من المستقبلات على سطح الخلية 1 إلى تشكيل di-/oligomers، والذي يظهر أن تشارك في التنظيم صقلها من نقل الإشارة و قد يكون لها عواقب فيزيولوجية والدوائية الهامة 2-5.
واحدة جزيء المجهري لديه إمكانات كبيرة من تصور مباشرة مع spatiotemp عاليةقرار شفوي السلوك الديناميكي للمستقبلات الفردية الموجودة على سطح الخلايا الحية، بما في ذلك ارتباطهم لتشكيل dimers وأعلى ترتيب المجمعات الجزيئية 6-10. هذا يوفر مزايا عدة بالمقارنة مع الطرق البيوكيميائية والمجهري القياسية، والتي عادة ما يقدم تقريرا متوسط السلوك الآلاف أو الملايين من الجزيئات.
وضع العلامات البروتين مع fluorophore مشرق وصامد كاف أمر ضروري لجزيء واحد المجهري. هذا البروتوكول يستفيد من العلامة SNAP أدخلت مؤخرا 11 لنعلق تساهميا fluorophores العضوية الصغيرة ومشرق لمستقبلات سطح الخلية. SNAP هو 20 دينار كويتي علامة البروتين المستمد من إصلاح الحمض النووي انزيم O-DNA alkyltransferase 6 alkylguanine الإنسان، والتي يمكن أن توصف بشكل لا رجعة فيه مع fluorophore مترافق benzylguanine (fluorophore-BG) المشتقات. CLIP، علامة مزيد المهندسة المستمدة من SNAP، يمكن بدلا من ذلك المسمى مع fluorophore جالمشتقات benzylcytosine onjugated 12.
بروتوكول ورد في هذا المخطوط يشرح كيفية بالنقل والتسمية SNAP-11 مستقبلات الموسومة مع fluorophores العضوية الصغيرة واستخدام مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهري لتصور واحد أو المجمعات مستقبلات مستقبلات على سطح الخلايا الحية 10. نتائج بروتوكول ورد في> 90٪ كفاءة تسمية أحد SNAP الموسومة بروتين سطح الخلية خارج الخلية 10. ، يتم توفير مزيد من المعلومات حول كيفية استخدام بيانات واحدة جزيء لتحليل حجم وتنقل مستقبلات المجمعات، وكذلك لالتقاط عابرة التفاعلات مستقبلات مستقبلات. ويرد سير العمل التخطيطي للبروتوكول كامل في الشكل 1. وكمثال على ذلك، فإن ترنسفكأيشن الصينية الهامستر المبيض (شو) الخلايا مع SNAP الموسومة G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs)، يليه وضع العلامات مع مشتق fluorophore-BG كما وكذلك تطبيقه على quantifذ موصوفة ورصد مستقبلات di-/oligomerization. ويمكن تمديد هذا البروتوكول إلى غيرها من البروتينات على سطح الخلية والعلامات الفلورية (على سبيل المثال، CLIP)، فضلا عن وضع العلامات وترنسفكأيشن أساليب أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول صفها يسمح تحليل الترتيب المكاني، والتنقل وحجم المجمعات مستقبلات سطح الخلية في مستوى واحد جزيء. بالمقارنة مع استخدام البروتينات الفلورية، ووضع العلامات مع fluorophores العضوية الصغيرة، والتي هي أكثر إشراقا وأكثر صامد، لديه ميزة السماح التصور طويلة من جزيئات مست…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
Referencias
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nat Methods. 4, 319-321 (2007).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
