Haute résolution spatio-temporelle d'analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
Microscopie de molécule unique est en train de devenir une approche puissante pour analyser le comportement de molécules de signalisation, en particulier concernant les aspects (par exemple., La cinétique, la coexistence de différents états et des populations, des interactions transitoires), qui sont généralement cachés dans des mesures d'ensemble, tels que celles obtenues avec des procédés biochimiques ou microscopie standard. Ainsi, les événements dynamiques, tels que les interactions récepteur-récepteur, peuvent être suivies en temps réel dans une cellule vivante avec une résolution spatio-temporelle élevée. Ce protocole décrit une méthode basée sur l'étiquetage de petites et lumineuses fluorophores organiques et totale de fluorescence à réflexion interne (FRBR) de microscopie pour visualiser directement les récepteurs simples sur la surface de cellules vivantes. Cette approche permet de localiser précisément des récepteurs, de mesurer la taille de complexes de récepteurs, et capturer les événements dynamiques tels que les interactions récepteur-récepteur transitoire. Le protocole fournit une description détaillée de la façon de perform une expérience unique molécule, y compris la préparation de l'échantillon, l'acquisition de l'image et l'analyse d'image. A titre d'exemple, l'application de cette méthode pour analyser deux G-récepteurs couplés aux protéines, c'est à dire., Β 2-adrénergiques et γ-aminobutyrique de type acide B (GABA B) récepteur, est rapporté. Le protocole peut être adapté à d'autres protéines de membrane et des modèles de cellules différentes, les méthodes de transfection et les stratégies de marquage.
Introduction
Des récepteurs situés à la surface des cellules détectent l'environnement extracellulaire et de répondre à une variété de stimuli, tels que des agents odorants, des ions, des neurotransmetteurs petites et de grandes hormones protéiques. La nature du fluide des membranes cellulaires permet des mouvements de récepteurs et d'autres protéines membranaires. Ceci est essentiel pour la formation de complexes de protéines et la survenue d'interactions protéine-protéine transitoires, telles que celles utilisées par les récepteurs de s'assembler en des unités fonctionnelles et la transduction de signaux à l'intérieur de la cellule. Par exemple, G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG), qui constituent la plus grande famille de récepteurs de surface cellulaire 1, ont été proposées pour former di-/oligomers, ce qui semble être impliquée dans la régulation de fine de la transduction du signal et pourrait avoir des conséquences physiologiques et pharmacologiques importantes 2-5.
Microscopie seule molécule a le grand potentiel de visualiser directement avec grande spatiotemprésolution par voie orale le comportement dynamique de récepteurs individuels situés sur la surface de cellules vivantes, y compris leur association pour former des dimères et des complexes moléculaires d'ordre supérieur 10.6. Cette offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes biochimiques et de microscopie standard, qui relèvent habituellement le comportement moyen des milliers ou des millions de molécules.
étiquetage des protéines avec un fluorophore suffisamment lumineux et photostable est essentiel pour la microscopie de molécule unique. Ce protocole prend avantage de l'étiquette SNAP récemment introduit 11 à fixer de façon covalente les petites et les fluorophores organiques lumineuses à des récepteurs de surface cellulaire. SNAP est une étiquette 20 kD de la protéine dérivée de la réparation de l'ADN enzyme O 6-alkylguanine-ADN alkyltransférase humaine, qui peut être irréversiblement marqué avec un fluorophore conjugué benzylguanine des dérivés (fluorophore-BG). CLIP, un tag en outre conçu dérivé de SNAP, peut être à la place marquée avec un fluorophore cles dérivés de benzylcytosine onjugated 12.
Le protocole rapporté dans ce manuscrit explique comment transfecter et étiquette SNAP-étiqueté 11 récepteurs avec des petits fluorophores organiques et l'utilisation totale de fluorescence à réflexion interne (FRBR) de microscopie pour visualiser les récepteurs simples ou complexes de récepteurs à la surface des cellules vivantes 10. Les résultats de protocole signalés dans> 90% d'efficacité de l'étiquetage d'un SNAP-protéine marquée extracellulaire à la surface cellulaire 10. De plus amples informations sur la manière d'utiliser les données d'une seule molécule à analyser la taille et la mobilité des complexes de récepteurs, ainsi que pour capturer des interactions récepteur-récepteur transitoire, il est prévu. Un flux de travail schématique de l'ensemble du protocole est donné dans la figure 1. A titre d'exemple, la transfection de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) avec G-récepteurs couplés aux protéines SNAP-tag (RCPG) suivie par marquage avec un dérivé fluorophore BG que ainsi que son application à QUANTIFy et moniteur récepteur di-/oligomerization sont décrits. Ce protocole peut être étendu à d'autres protéines de surface cellulaire et des marqueurs fluorescents (par exemple., CLIP), ainsi que d'autres méthodes de transfection et d'étiquetage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit permet l'analyse de l'agencement spatial, la mobilité et la taille des complexes de récepteurs de surface cellulaire au niveau d'une seule molécule. Par rapport à l'utilisation de protéines fluorescentes, le marquage avec de petites fluorophores organiques, qui sont plus lumineux et plus photostable, a l'avantage de permettre une visualisation étendue de particules de récepteurs individuels. Etant donné que les niveaux d'expression obtenus sont extrêmement faibles (&…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
Referencias
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