単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
単一分子顕微鏡は、これらの側面（ 例えば 、動力学、異なる状態や集団、一時的な相互作用の共存）は、一般的にアンサンブル測定で隠されている、などに関して、特に、シグナル伝達分子の挙動を解析するための強力なアプローチとして浮上している標準的な生化学的または顕微鏡の方法で得られたもの。従って、このような受容体 – 受容体相互作用などの動的イベントは、高時空間解像度で生細胞におけるリアルタイムで追跡することができる。このプロトコルは、小さくて明るい有機蛍光団と直接生きた細胞の表面上の単一の受容体を可視化する全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いた標識に基づく方法について説明します。このアプローチは、いずれかが正確に、受容体を局在化受容体複合体のサイズを測定し、そのような一過性受容体 – 受容体相互作用などの動的イベントをキャプチャすることを可能にする。プロトコルは、PE方法の詳細な説明を提供しています試料調製、画像取得および画像解析を含む単一分子実験を、rform。一例として、2つのG-タンパク質共役受容体を分析するこの方法の適用、 すなわち 、β2 -アドレナリン及びγ-アミノ酪酸タイプB（GABA B）は受容体が報告されている。プロトコルは、他の膜タンパク質および異なる細胞モデル、トランスフェクション法および標識戦略に適合させることができる。
Introduction
受容体は、細胞表面感覚細胞外環境に位置しており、このような臭気物質、イオン、小神経伝達物質および大きいタンパク質ホルモンのような様々な刺激に応答する。細胞膜の流動性は、受容体及び他の膜タンパク質の移動を可能にする。これは、タンパク質複合体およびそのような機能単位にアセンブルし、細胞内部にシグナルを伝達する受容体によって使用されるような一過性のタンパク質 – タンパク質相互作用の発生の形成に必須である。例えば、細胞表面受容体1の最も大きなファミリーを構成するG-タンパク質共役受容体（GPCR）は、シグナル伝達の微調整調節に関与することが表示され、di-/oligomersを形成することが示唆されている重要な生理的および薬理学的結果2-5があるかもしれません。
単一分子顕微鏡で直接高spatiotempで可視化する大きな可能性を秘めている経口解像度の関連付けを含む生きている細胞の表面上に位置する個々の受容体の動的挙動は、二量体およびより高次の分子複合体6-10を形成する。これは通常、分子の数千から数百万の平均的挙動を報告し、標準的な生化学的および顕微鏡の方法に比べていくつかの利点を提供しています。
十分に明るく、光安定性、フルオロフォアとタンパク質標識は、単一分子顕微鏡検査のために不可欠です。このプロトコルは、共有結合し、細胞表面の受容体に小さな、明るい有機蛍光団を接続するために最近導入され、SNAPタグ11を利用しています。 SNAPは、不可逆的に蛍光団結合ベンジルグアニン（BG-フルオロフォア）誘導体で標識することができるヒトDNA修復酵素のO 6 -アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼに由来する20 kDのタンパク質タグである。 CLIP、SNAPに由来し、さらに設計タグは、代わりに蛍光団-Cで標識することができるonjugatedベンジルシトシン誘導体12。
本稿で報告されたプロトコルは、トランスフェクトし、ラベルの小さい有機蛍光団との11の受容体をSNAP-タグおよび生細胞10の表面上の単一の受容体または受容体複合体を視覚化するために全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を使用する方法について説明します。細胞外SNAP-タグ化細胞表面タンパク質10の> 90％の標識効率の報告されたプロトコールをもたらす。受容体複合体のサイズおよび移動度を分析するために、ならびに一過性受容体 – 受容体相互作用を捕捉するために単一分子データを使用する方法に関するさらなる情報は、提供される。プロトコル全体の概略的なワークフローは、 図1に示されている。一例として、SNAP-タグ化Gタンパク質共役受容体（GPCR）を有するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のトランスフェクションは、フルオロフォア-BG誘導体で標識し、続いてよくquantifへの応用として、yおよびモニタ受容体di-/oligomerizationが記載されている。このプロトコルは、他の細胞表面タンパク質と蛍光タグ（ 例えば 、CLIP）、ならびに他のトランスフェクションおよび標識方法にまで拡張することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコルは、単一分子レベルでの細胞表面受容体複合体の空間的配置、移動度及びサイズの分析を可能にする。蛍光タンパク質の使用と比較して、より明るく光安定性である小さな有機フルオロフォアで標識化は、単一の受容体粒子の可視化を拡張できるという利点を有する。非常に低い発現レベルが達成されているので（<0.45レセプター個/μm2）は 、受容体および他…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
Referencias
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