Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
Микроскопия одиночных молекул становится мощным подхода для анализа поведения сигнальных молекул, в частности в отношении тех аспектов (например,., Кинетика, сосуществование различных государств и групп населения, переходных взаимодействий), которые, как правило, скрыты в измерениях ансамбль, например, результатами, полученными с помощью стандартных биохимических или микроскопии методов. Таким образом, динамические события, такие как взаимодействия рецептор-рецепторов, можно проследить в режиме реального времени в живой клетке с высокой пространственно-временной резолюции. Этот протокол описывает метод, основанный на маркировке с небольшими светлыми и органических флуорофоров и полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия непосредственно визуализировать одиночные рецепторы на поверхности живых клеток. Такой подход позволяет точно локализовать рецепторы, измерить размер рецепторных комплексов, а также захватить динамические события, такие как переходных взаимодействий рецептор-рецепторов. Протокол содержит подробное описание того, как реrform эксперимент в одиночных молекул, в том числе подготовки проб, получения изображений и анализа изображений. В качестве примера, применение этого метода для анализа двух G-белком рецепторы, то есть., Β 2-адренорецепторов и γ-аминомасляной кислоты типа B (ГАМК B) рецептор, не сообщается. Протокол может быть адаптирована к других мембранных белков и различных моделей клеток, методы трансфекции и стратегии маркировки.
Introduction
Рецепторы, расположенные на поверхности клеток ощутить внеклеточную среду и отвечать на различные стимулы, такие как отдушки, ионов малых нейротрансмиттеров и крупных белковых гормонов. Жидкость характер клеточных мембран позволяет движения рецепторов и других мембранных белков. Это необходимо для формирования белковых комплексов и возникновением переходных белок-белковых взаимодействий, таких как те, что используются рецепторов собрать в функциональных блоков и преобразовывать сигналы в внутрь клетки. Например, G-белком рецепторы (GPCR), которые составляют самый большой семейство рецепторов клеточной поверхности 1, были предложены для формирования di-/oligomers, которые, как представляется, участвуют в регуляции тонкой настройки передачи сигнала и могут иметь важные физиологические и фармакологические последствия, 2-5.
Микроскопия одиночных молекул имеет большой потенциал непосредственно визуализации с высоким spatiotempоральный разрешение динамическое поведение отдельных рецепторов, расположенных на поверхности живых клеток, в том числе их ассоциации с образованием димеров и высших порядков молекулярные комплексы 6-10. Это дает несколько преимуществ по сравнению со стандартными биохимическими и микроскопии методов, которые обычно сообщают среднее поведение тысяч или миллионы молекул.
Белок маркировка с достаточно яркой и фотостабильным флуорофором имеет важное значение для микроскопии одиночных молекул. Этот протокол использует недавно введенной SNAP тега 11 ковалентно присоединить небольшие и яркие органические флуорофоры чтобы рецепторами клеточной поверхности. SNAP является кДа белок тег 20 происходит от человека фермент репарации ДНК алкилтрансферазы O 6-алкилгуанин-ДНК, который может быть необратимо меченного флуорофора, конъюгированным бензилгуанином (флуорофор-BG) производные. CLIP, еще инженерии тег происходит от SNAP, можно вместо помечены флуорофора-сonjugated производные benzylcytosine 12.
Протокол сообщалось в этой рукописи объясняет, как трансфекции и этикетка SNAP-11 помечены рецепторы с малыми органическими флуорофоров и использовать полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия для визуализации одиночных рецепторы или рецепторных комплексов на поверхности живых клеток 10. Представленные результаты протокола на> 90% эффективности маркировки на внеклеточно SNAP-меченых клеток поверхностного белка 10. Более подробную информацию о том, как использовать данные одной молекулы анализировать размер и подвижность рецепторных комплексов, а также на захват переходных взаимодействий рецептор-рецептор, предоставляется. Схематическое рабочий процесс всей протокола дается на рисунке 1. Например, трансфекция яичника китайского хомячка (СНО) с SNAP-меченых G-белком рецепторы (GPCR) следуют маркировка с производным флуорофором BG как а также его применение в quantifу и di-/oligomerization рецепторов монитор описаны. Этот протокол может быть распространен и на другие поверхности клеток белков и флуоресцентных меток (например., Клип), а также на другие трансфекции и маркировки методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол позволяет анализ пространственного расположения, подвижности и размера рецепторных комплексов на поверхности клеток на уровне отдельных молекул. По сравнению с использованием флуоресцирующих белков, маркировка с малых органических флуорофоров, которые светлее и…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
Referencias
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nat Methods. 4, 319-321 (2007).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
