マウス精巣の生体内マイクロインジェクションやエレクトロポレーションで
Summary
この記事では、精子形成のユニークなプロセスを研究するために精巣マウス細胞のトランスフェクション技術としてインビボでマウス精巣のマイクロインジェクションやエレクトロポレーションについて説明します。提示されたプロトコルは、ガラスキャピラリーの準備、輸出管を経由してマイクロインジェクション、エレクトロポレーションによるトランスフェクションの工程を含む。
Abstract
このビデオでは、物品の寄与はマイクロインジェクションおよびin vivoでのマウス精巣のエレクトロポレーションの包括的な説明を提供します。精巣マウス細胞のこの特定のトランスフェクション技術は、精子形成におけるユニークなプロセスの研究を可能にします。
以下のプロトコルは、プラスミド構築物で精巣マウス細胞のトランスフェクションに焦点を当てています。具体的には、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）および赤色蛍光タンパク質（DsRed2の）を発現するpDsRed2-N1ベクターを発現するレポーターベクターのpEGFP-C1を用いた。両方の符号化されたレポーター遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV）の制御下にあった。
マウスの精巣への遺伝子導入を行うために、レポータープラスミド構築物は、生きているマウスの精巣に注入される。そのために、麻酔した動物の精巣を露出し、マイクロインジェクションの部位を調製する。当社の優先場所注射は、精巣および精巣上体の間に精子の解剖輸送ルートとして、最終的に接続された精巣網で、輸出管である。このように、マイクロインジェクション後の精細管の充填が良好に起因染色DNA溶液の使用を管理および制御される。その色の細管構造によって精巣の十分な充填を観察した後、臓器をエレクトロポレーションされています。これは、精巣細胞へのDNA溶液を転送することができます。インキュベーションの3日後、精巣を除去し、そしてトランスフェクションの成功を示す、緑色または赤色蛍光について顕微鏡下で調べた。
一般的に、このプロトコルは、DNAまたはRNA-を配信するために使用することができるが、するために生きているマウスの精巣に構築（オーバー）を発現またはin vivo遺伝子機能解析に容易に遺伝子をノックダウン。さらに、レポーター構築物又は推定上の遺伝子レグラを研究するのに適しているトーリー要素。このように、エレクトロポレーション技術の主な利点は、低労力と組み合わせて、高速なパフォーマンスだけでなく、代替技術と比較して必要な適度な技術設備とスキルです。
Introduction
哺乳動物の精子形成を連続して成熟した半数体精子へと発展させるために、有糸分裂、減数分裂および分化を受けている自己再生幹細胞の洗練されたプロセスであると考えられる。これらの形態学的変化は、異なる細胞型によって編成され、深遠な試みにもかかわらず、それは細胞培養1,2に、これらのプロセスを模倣することは不可能である。そのため、今までの精子形成の研究は、in vivoモデルとして生物に依存しています。一般に、遺伝子機能の研究は、通常、トランスジェニック動物に基づいている。しかしながら、動物モデルのこの種を生成し、維持することは時間がかかり、コストがかかり、非常に精巧である。これは、世代にわたって導入遺伝子を生成し、維持するために必要な長い育種プロセスに起因する。グラムをターゲットにするとさらに、トランスジェニックまたはノックアウトアプローチによる生物全体の遺伝子操作は、生理的障害を引き起こす傾向がある複数の地域に不可欠な機能を備えたエン例えば 、精巣の外側または全身。
さらに、いくつかの一過性のトランスフェクション法は、いくつかの重大な欠点に関連している。リポフェクション3および微粒子ボンバードメント4が組織に損傷を与える可能性があり、十分なトランスフェクション効率のための特定のセルの深さに制限されているのに対し、例えば、ウイルス媒介遺伝子導入の典型的な欠点は、免疫反応および追加の安全規制の可能挑発である。
これとは対照的に、一過性トランスフェクションの別の一般的な方法として、エレクトロポレーション（EP）は、 生体内でトランスフェクションおよび一貫性のあるin vivoでの遺伝子解析に有効にするための有望な技術を構成しているようだ。一般的に、EPはナノ秒以内に結果的に媒介される細孔を有するローカル膜貫通電圧に依存する動的な現象と呼ばれている。これらのギャップは、ミリ秒間維持することができ、十分なトンO DNA、RNA、または小分子5へのアクセス権を付与します。印加電圧が高すぎると、EPの通常は一時文字は、熱産生およびセル5の結果として不可逆的な損傷があまりにも包括的透過性の誘導に打ち消される。
ここでは、エレクトロポレーションは、in vivoでの精巣の遺伝子特性を解明するために、遺伝的精巣形質転換のために利用されることができる効果的かつ経済的なトランスフェクション系であることを示している。この記事では、輸出管およびマウス精巣のその後のエレクトロポレーションを介したプラスミド調製、マイクロインジェクションに対応しています。この手順は、精子形成の過程を調べるために、in vivoでのマウス精巣の精細管の、速く特異的かつ効率的なトランスフェクションを達成するための最適な手段となり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
生殖生物学の分野での研究が、特に男性の生殖能力と精子形成の分野で、必然的に生物に依存しています。精巣機能を調べるために、充分な細胞培養/ in vitro系は半数体精子成熟1,2の二倍体精原細胞からのすべての重要な形態学的変化を反映することが可能な確立されていない。このように、遺伝子改変動物の発生がしばしば必要と男性生殖生物学のような貴重な?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、精巣マイクロインジェクションを教えるためのミュンスター大学で生殖医療アンドロロジーのセンターのビルギットWesternstroeerに感謝します。加えて、私たちは技術支援のためのウルスラAntkewitzとペトラRecklingに感謝しています。私たちは、この作品（WE2458 / 10-1）を支持するためのドイツ研究財団（DFG）をお願いいたします 。
Materials
|
centrifuge |
Sigma | 1-15 PK | |
| spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder |
|
| fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| surgical suture | Catgut 00 | Catgut Markenkirchen |
|
| syringe, with 30G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10x PBS, pH 7.4 | Carl Roth | 3957.1 | NaCl [1.37 M] |
| 6781.1 | KCl [27 mM] | ||
| T106.2 | Na2HPO4+2H2O [100 mM] | ||
| 3904.1 | KH2PO4 [18 mM] | ||
| 10% Ketamin | Serum Werk Bernburg |
Urotamin | mix in a rate 1:1 |
| 2% Xylazin | Serum Werk Bernburg |
Xylazin | |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| vet ointment | S&K Pharma GmbH |
Kerato Biciron 5% Augensalbe |
or similar to prevent dryness of eyes |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 |
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